Récupération et conservation des levures

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Récupération des levures

Pour récupérer et réutiliser des levures, plusieurs choix s’offrent au brassam :

  • Récupérer une partie du krausen
    • Avantages : facilité de récupération, utilisation immédiate possible car levures en phase exponentielles
    • Inconvénients : ouverture du fermenteur : risque d’infection, obligation de récupérer un large volume de Krausen car les levures y sont très diluées et sélection de levures peu floculantes.

 

  • Récupérer le fond du fermenteur
    • Soit au moment du transfert après la phase tumultueuse
    • Soit au moment du transfert en cuve de sucrage
      • Avantages : facilité et volume de récupération
      • Inconvénients : sélectionne les levures les plus floculantes, nécessite beaucoup de lavage car la lie contient beaucoup de résidus autre que des levures sédimentées : houblon, cassure, reste de malt mal filtrés etc.

 

  • Récupérer une partie du starter
    • Avantages : facilité de récupération, nécessite moins de lavage, levure moins stressées.
    • Inconvénient : nécessité de surdimensionné son starter.

 

  • Récupérer directement une partie du sachet/tube de levure du commerce
    • Avantages : récupération de levures « pures »
    • Inconvénients : faible volume de levure et vitalité faible si sachet vieux.

 

  • Récupérer les levures depuis un fond de bouteille
    • Avantages : solution économique, permet de faire des clones proches des bières originelles
    • Inconvénients : doute sur la souche utilisée, doute sur utilisation d’une levure de refermentation, risque d’échec, levures stressée par la présence en bouteille, la pression, l’alcool etc.

 

Dans toutes ces méthodes, l’objectif est de récupérer une quantité de levure permettant une bonne conservation (de quelques ml à quelques cl).

 

Le problème commun à toutes ces méthodes est d’estimer le nombre et la vitalité des cellules récupérées. Beaucoup de chiffre circule mais seul un comptage au microscope permet d’avoir une estimation fiable de la concentration cellulaire.  Un chiffre qui revient souvent de 1mds/mL est généralement très sous-évalué s’il s’agit d’un culot de levure.</w:wrap></w:wrap>

 


Récupération d’une partie du krausen : 

Au moment où il est le plus haut (24 à 48h après ensemencement), récupérer une partie du krausen sachant qu’environ 10cL de « crème » seraient nécessaire pour ensemencer 20L de bière (de 5 à 15cL selon les auteurs). On entend par crème, la mousse retombée. Et la mousse perd 80% de son volume en retombant. Donc il faudrait environ 50cL de mousse pour un brassin de 20L.

 


Récupération depuis un fond de fermenteur :

  • Une fois la cuve vidée, préparer une solution isotonique stérile et en verser une partie au fond du fermenteur
  • A l’aide d’un ustensile stérile, prélever une partie du contenu des lies diluées
  • Placer dans un contenant (nonopaque) stérile et mettre au frais pendant quelques heures pour laisser décanter.</w:wrap>
  • On obtient une solution avec trois phases :
    • La partie haute : liquide plus ou moins coloré
    • La partie basse : grumeleuse, grossière
    • La partie centrale : claire, homogène, crémeuse.
  • A l’aide d’une seringue stérile, prélever la partie du milieu : ce sont les levures floculées.
  • Rincer les levures en les mélangeant à nouveau avec une solution isotonique stérile, laisser décanter, éliminer le surnageant et répéter l’opération autant de fois que nécessaire pour que le surnageant soit le plus clair possible.

 


Récupération depuis un starter :

  • Dans l’idéal la récupération doit se faire durant la phase exponentielle du starter : dans le haut de sa courbe de croissance, avant la phase stationnaire
  • Mettre au frais plusieurs heures afin de faire déposer le maximum de levure.
  • Récupérer une partie ce cellesci à l’aide d’une seringue stérile (l’autre partie servira à ensemencer le futur brassin)
  • Mettre les levures récupérées dans un récipient stérile et procéder au rinçage si nécessaire : mélanger avec une solution isotonique, laisser décanter plusieurs heure au frais et éliminer le surnageant.

 


Récupération depuis un fond de bouteille :

Les levures présentes au fond d’une bouteille de bière (refermentée en bouteille) ne sont pas assez nombreuses pour être conservées directement et sont stressés par la présence en bouteilles, l’absence de nutriment, la pression, l’alcool etc. L’idée est donc de faire un starter ensemencé à partir ce fond de bouteille. Un processus pourrait-être :

  • Récupérer une (ou plusieurs) bouteille de bière (refermentée en bouteille sans levure de refermentation) la plus récente possible. La stocker au frais verticalement plusieurs jours.
  • La décapsuler, stériliser le goulot à la flamme, verser environ les 3/4 dans un verre pour consommation immédiate.
  • Préparer 25cL de moût stérile, refroidi à 2030°C à 1020 de densité et dans l’idéal enrichi par ajout de YPD ou de 20 g de glucose et 20 g d’extrait de malt. Y verser le fond de bouteille (agité) et mettre sur agitateur 24h.
  • Rajouter 25cL de moût stérile à 1040 de densité et laisser sur agitateur 24h
  • Selon la quantité désirée ou la volonté d’ensemencer directement un brassin, cette opération peut être répétée plusieurs fois.
  • Mettre au frais plusieurs heures/jours afin de faire sédimenter les levures.
  • Rincer si nécessaire à l’aide d’une solution isotonique.

 


Récupération à partir d’un sachet de levure

  • Ouvrir le sachet, utiliser une partie pour ensemencer le pied de cuve ou le brassin, garder le reste.

 

 

 


Conservation des levures

 

Une fois les quelques ml de levures récupérées, plusieurs choix s’offrent au brassam pour les conserver :

  • Conservation en solution isotonique
    • Durée de conservation : 6-12 mois au frigo, possiblement plus.
    • Utilisation : comme une levure liquide standard : faire un starter est toujours préférable.

 

  • Congélation 
    • Durée de conservation : plusieurs années à -18°C (congélateur classique) plusieurs dizaines d’années/indéfiniment si congélateur de laboratoire à -70 -80°C.
    • Utilisation 1 : gratter le dessus avec une aiguille stérile et ensemencer une gélose (cf. ensemencement plus bas) puis suivre le protocole d’utilisation des levures conservées sur gélose ci-dessous.
    • Utilisation 2 : décongeler un tube à température ambiante et se servir de la totalité de celui-ci pour lancer un starter. Cette méthode et plus simple mais empêche de facto une conservation de la souche puisque la totalité du tube est utilisée.

 

  • Conservation sur gélose
    • Durée de conservation : 1 à 2 mois sans repiquage et jusqu’à 12 mois si la gélose n’est pas trop fine et que le réfrigérateur ne provoque pas de dessiccation.
    • Utilisation : nécessite d’être amplifiées. Un protocole pourrait-être :
      • Prélever une colonie et la placer dans un tube contenant 10 ml de moût.
      • Agiter le tube toutes les 4h pour apporter de l'oxygène et permettre un développement rapide des levures.
      • 24h après ajouter environ 5cl de moût et agiter toutes les 4h.
      • 24h après ajouter 15-20cl de moût et placer sur agitateur.
      • Recommencer la dernière opération jusqu’à obtenir un starter prêt à ensemencer.

 


Conservation en solution isotonique

  • Une fois la levure sédimentée récupérée, placer dans un récipient stérile (tube à centrifuger par exemple) avec une solution isotonique stérile avec un ratio 1/5 levure et 4/5 solution.
  • Placer au réfrigérateur
  • Si on est équipé d’une centrifugeuse, il est possible de centrifuger les tubes afin d’augmenter la concentration du culot. Pour cela :
    • Placer la levure sédimenter dans un tube à centrifuger
    • Appliquer une force de 2500g pendant 5 minutes. Sachant que :
      • g = 1.119*10-5*r*rpm² où r est le rayon de rotation du rotor en cm pris du centre de l’axe jusqu’au fond du tube une fois celui-ci à l’horizontale.
      • Soir rpm =v[g/(1.119*105*r)]
      • Une fois centrifugé, ajouter 4 volume de solution isotonique pour arriver à la concentration 1/5 - 4/5

 


Congélation

Pour congeler, le principe va être de protéger nos levures grâce au glycérol.

Pour un congélateur traditionnel à -18°C

  • Préparer une solution à environ 15% de glycérol
    • Mélanger 1 volume de glycérol pour 2 volumes d’eau stérile (33% de glycérol).
    • Mélanger 1 volume de liquide ainsi obtenu à 1 volume de levure (16.5% de glycérol).
  • Mettre dans des tubes puis au congélateur.

 

Pour un congélateur de laboratoire à -80°C

  • Préparer une solution à environ 25% de glycérol
    • Mélanger 1 volume de glycérol pour 1 volume d’eau stérile (50% de glycérol).
    • Mélanger 1 volume de liquide ainsi obtenu à 1 volume de levure (25% de glycérol).
  • Mettre dans des tubes puis au congélateur.

 

Conservation sur gélose (post de Lapin fou: https://www.brassageamateur.com/forum/ltopic10333-127617.html)

Nettoyage, stérilisation, méthodologie générale (Doit être appliqué pour chaque séance de travail)

  • S'assurer que le plan de travail soit bien horizontal (niveau à bulle)
  • Passer tous les ustensiles à l'autocuiseur (cocotteminute):
    • Mettre 1 à 2 cm d'eau au fond de l'autocuiseur
    • Disposer tous le matériel dans le panier pour cuisson vapeur
    • Envelopper le petit matériel (boite pétri, etc.) dans du papier alu
    • Les flacons doivent être bouchés sommairement et non hermétiquement
    • Fermer cocotte et faire chauffer. Laisser chauffer au moins 20 minutes après la rotation de la soupape.
  • Nettoyer le plan de travail à l'alcool à 70 (attention l'alcool est très inflammable).
  • Poser une couche de papier aluminium sur le plan de travail
  • Passer un coup d'alcool à 70 sur ce film
    • ATTENDRE QUE L'ALCOOL SOIT TOTALEMENT EVAPORE POUR ALLUMER LE BEC BUNSEN
  • Se laver soigneusement les mains, passer un coup de brosse sous les ongles.
  • Se frictionner les mains à l'alcool et laisser sécher.
  • Positionner tout ce dont on aura besoin sur le plan de travail afin d'éviter mouvement inutiles.
  • Portez un masque et évitez de parler, de faire des mouvements brusques ou de provoquer des courants d'air
  • Limitez au maximum le temps d'ouverture de tous les contenants
  • Allumer le bec bunsen et laissezle allumé tout au long des préparations
  • Cela créer une zone stérile dans un cercle de 20cm autour de la flamme
  • Toutes les opérations doivent être faites dans cette zone
    </ul>

    </ul>

    Préparation de la gélose:

    • Nettoyer l'environnement de travail et les ustensiles (cf. supra : "Nettoyage, stérilisation, méthodologie générale")
    • Nous aurons besoin de moût : soit prélevé lors d'un précédent brassage, soit brassé à cet effet, soit préparé avec de l'extrait de moût (cf.infra : « Préparation de moût pour starter/culture »)
    • Mélanger entre 20g d'agar dans un litre de ce moût
    • Transvaser dans différents récipients, l'un devant permettre de préparer les boites que nous allons utiliser, les autres permettant de conserver sa solution de gélose pour les futurs repiquages.
    • Mettre un fond d'eau (1 à 2cm) dans l'autocuiseur.
      • Placer les récipients contenant l'agar dans l'autocuiseur.
      • Les bouchons posés mais légèrement ouverts.
      • Placer une feuille de papier alu sur bouchons et cols des récipients.
      • Faire chauffer et attendre 20min après la rotation de la soupape.
      • Laisser refroidir lentement dans l'autocuiseur.
      • Ouvrir l'autocuiseur et fermer les bouchons.
    • Garder quelques pots de gélose pour le futur, conservation à température ambiante.

     

    Préparation des boites de Pétri

    • Dans ces boîtes, les levures seront cultivées et conservées (1 mois au frais).
    • Nettoyer l'environnement de travail et les ustensiles (cf. supra : "Nettoyage, stérilisation, méthodologie générale").
    • Ouvrir légèrement le bouchon d’une boite stérile contenant la gélose.
    • Placer la boite dans un bain marie et chauffer jusqu'à liquéfaction de la gélose.
      • La gélose doit avoir être à environ 65°C.
    • Allumer bec bunsen à petit foyer (Bleuet).
      • Disposer les boites de pétri dans un rayon de 20cm autour de la flamme.
      • Toutes les manipulations doivent s'effectuer dans cette zone.
    • Prenez un pot de gélose avec un gant et verser les boites de pétri.
    • La couche de gélose doit avoir une épaisseur de 5mm et être bien horizontale.
    • Poser les couvercles sur les boites et laisser refroidir.
    • Une fois refroidie passer rapidement la gélose à la flamme
    • Dessécher à la flamme l'excès éventuel d'humidité qui peut se trouver dans les couvercles
    • Si on veut conserver des boites de gélose pour une utilisation future, les fermer avec du sparadrap stérile et les mettre au réfrigérateur à l'envers (gélose en haut).

     

    Ensemencement

    • Nettoyer l'environnement de travail et les ustensiles (cf. supra : "Nettoyage, stérilisation, méthodologie générale")
    • Allumer le bec bunsen
    • Placer les boites de pétri dans une zone à moins de 20cm du bec et les ouvrir
    • Passez l'ose d’inoculation à la flamme
    • Attendre qu'elle refroidisse (sans la sortir de la zone stérile de 20cm)
    • Plonger l'ose dans l'échantillon de levure liquide à cultiver, pour extraire une goute la plus petite possible
    • Faire un étalement selon la méthode des cadrans (voir : http://www.didierpol.net/3isol.htm):
      • Diviser mentalement la boîte en 3 ou 4 secteurs ou s’aider d’une matrice placée sous la boîte et déposer l'échantillon en laissant traîner l'extrémité de l'anse en zig zag dans le premier secteur de la périphérie vers le centre de la boîte
      • Repasser l'anse à la flamme, la laisser refroidir (sans la sortir de la zone stérile), faire tourner la boîte d'un secteur et repasser avec l'anse dans la partie supérieure du dépôt initial qu'on étalera dans le deuxième secteur comme précédemment sans recroiser le premier dépôt.
      • Procéder de la même façon pour les autres secteurs de la boîte : repasser l’anse dans une partie du secteur précèdent et « balayer » le nouveau secteur en prenant soin d’avoir préalablement passé l’anse à la flamme et laisser refroidir au sein de la zone stérile.
    • Fermer les boites de pétri et sceller avec un sparadrap sur le pourtour
    • Laisser les boites à une température entre 20 et 30°C  à l’envers pendant quelques jours et surveiller constamment l'apparition des colonies
    • Une bonne inoculation provoque des colonies totalement séparées
      • Dans le cas ou des colonies auraient des aspects ou couleurs différents des autres, il y'a contamination, jeter l'agar de la boite et stériliser le tout.
      • Si certaines colonies de la boites sont totalement isolées et semblent saines il est possible de les repiquer pour ensemencer une nouvelle boite de pétri.
    • Quand les colonies atteignent une bonne taille (dans les 1 ou 1,5 mm), placer les boites au frigo tête en bas (couvercle en bas) : les levures se conservent ainsi entre un et deux mois.

     

    Repiquage des levures (tous les mois)

    • Bien qu'elles puissent éventuellement être conservées plus longuement avec succès il est conseillé de repiquer tous les mois ses levures conservées.
    • Sortir du frigo une boite de pétri contenant la levure à repiquer ainsi qu'une boite de pétri contenant une couche d'agar vierge (ou en préparer une comme indiqué précédemment) laisser reposer à température ambiante.
    • Nettoyer l'environnement de travail et les ustensiles (cf. supra : "Nettoyage, stérilisation, méthodologie générale").
    • Remplir un tube à essais avec 5ml de sérum physiologique stérilisé.
    • Passer l'ose à la flamme et laisser refroidir.
    • Prélever quelques colonies dans la boite source à l'aide de l'ose.
    • Mettre les colonies en suspension dans le tube.
    • Passer l'ose à la flamme et laisser refroidir.
    • Prendre une goutte de suspension de levure à l'aide de l'ose.
    • Faire un étalement: ensemencer la gélose en frôlant la surface selon la méthode des cadrans en prenant soin de passer l'ose à la flamme entre chaque rotation de la boite
    • Fermer les boites de pétri et sceller avec un sparadrap sur le pourtour.
    • Laisser les boites à une température entre 20 et 30°C (selon les levures) pendant quelques jours et surveiller constamment l'apparition des colonies
      • Une bonne inoculation provoque des colonies totalement séparées.
      • Dans le cas ou des colonies auraient des aspects ou couleurs différents des autres, il y'a contamination, jeter l'agar de la boite et stériliser le tout.
      • Si certaines colonies de la boites sont totalement isolées et semblent saines il est possible de les repiquer pour ensemencer une nouvelle boite de pétri.
      • Quand les colonies atteignent une bonne taille (dans les 1 ou 1,5 mm), placer les boites au frigo tête en bas (couvercle en bas)
    • Les levures se conservent ainsi entre un et deux mois.

     

     


    Préparation de solution isotonique

    Dans une solution contenant des cellules, les milieux intra et extracellulaire sont séparés par la membrane de la cellule qui est semi-perméable : elle laisse passer certains solutés. Ainsi, le phénomène d’osmose amène l’eau à migrer du milieu le moins concentré vers le milieu le plus concentré en soluté afin de rétablir un équilibre.

    En d’autres termes, l’eau aura tendance à migrer :

    • De la cellule vers le milieu extérieur (entraînant sa déshydratation et possiblement sa mort) si celui-ci est plus concentré en soluté.
    • Du milieu extérieur vers la cellule (entraînant son gonflement et possiblement son éclatement) si celle-ci est plus concentrée en soluté.

    L’idée est donc de mettre les précieuses levures dans une solution ayant la même concentration en soluté que le milieu intracellulaire. Pour ce faire deux solutions (parmi d’autres) s’offrent au brassam :

    • Utiliser du sérum physiologique trouvable facilement en pharmacie.
    • Fabriquer une solution isotonique stérile à partir d’eau distillée ou à défaut déminéralisée et de sel « pur » donc non-iodé (les sels régénérant pour lave-vaisselle contenant plus de 99,9% de NaCl conviennent). La concentration en sel devra être de 9g/L.

     

    Avec une cocotte-minute (ou une autoclave)

    • Mettre quelques centimètres d’eau au fond de la cocotte.
    • Faire une solution en mélangeant 9g de sel pour un litre d’eau (bouillante éventuellement)
    • Disposer la solution dans des récipients autoclavable (flacons Schott, pots à confiture, bocaux style le parfait etc.).
    • Mettre les récipients remplis de solution dans le panier de la cocotte
      • Si les récipients ont un joint qui permet un échange gazeux de l’intérieur vers l’extérieur (pots à confiture, bocaux le parfait etc.) les fermer complètement
      • Si les récipients ont une fermeture hermétique (flacon Schott) les fermer à 80% et entourer le capuchon d’une feuille d’aluminium : pendant la stérilisation l’air dilaté pourra sortir du flacon sans le faire exploser et une fois le processus terminé on pourra les refermer sans toucher le capuchon (via l’aluminium).
    • Mettre la cocotte sur le feu et compter 20 minutes à partir du sifflement.
    • Attendre que la pression redescende naturellement, ouvrir la cocotte et visser éventuellement les capuchons sur les flacons hermétiques.

     

    Sans cocotte-minute

    • Le procédé est plus risqué vis-à-vis des infections éventuelles.
    • Mettre ses récipients et leur couvercle (séparés) dans une marmite, les recouvrir d’eau et porter à ébullition 10 minutes.
    • Préparer dans une casserole la solution à 9g de sel non iodé par litre et la faire bouillir 10 minutes
    • Sortir les récipients à l’aide d’une pince sans toucher l’intérieur.
    • Verser la solution bouillante à l’intérieur et fermer hermétiquement.
    • Il est aussi possible dans le cas de récipients possédant un joint (pots à confitures, bocaux style le parfait etc.) de les faire bouillir pleins recouvert d’eau pendant 30 minutes.

     

     


    Préparation de moût pour starter/culture

    Que ce soit pour réaliser un starter, pour multiplier les levures ou pour faire des géloses, le brassam a besoin de moût stérile à 1040 de densité. Ce dernier point étant l’optimum pour le développement des levures.

    Avant de le stériliser il faut donc créer ce moût et là encore, plusieurs solutions possibles :

    • A partir d’une solution sucrée
    • A partir d’extrait de malt sec/liquide
    • A partir de malt en grain
    • A partir de reste de filtration d’un précédent brassin

    Dans tous les cas le moût ainsi préparé devra être porté à ébullition 20 minutes immédiatement avant utilisation.

     

    A partir d’une solution sucrée

    Il s’agit simplement de mélanger du sucre dans de l’eau pour atteindre une densité de 1040 soit environ 100g de sucre pour 1kg de moût (pas pour un litre d’eau).

    • Avantage : solution très simple et très économique
    • Inconvénient : les levures ne seront pas dans un milieu proche de ce qu’elles connaitront lors du brassage et risque d’être plus stressées et moins efficace. Solution peu satisfaisante.

     

    A partir d’extrait de malt sec/liquide

    Il suffit simplement de mélanger l’extrait de malt et l’eau pour atteindre une densité de 1040 soit environ 110g d’extrait sec ou 130g d’extrait liquide pour un 1L de moût.

    • Avantage : solution très simple, milieu similaire au futur brassin
    • Inconvénient : solution onéreuse

     

    A partir d’extrait de malt en grain

    Il faut pour cette solution réaliser un « mini-brassin ». C’est-à-dire :

    • Broyer le malt (environ 180g de malt de base pour 1l de moût)
    • Empatter avec 1,2L d’eau pour obtenir un maximum de sucre fermentescible, c’està-dire aux alentours de 64°C
    • Filtrer
    • Porter à ébullition 20 minutes
      • Avantage : solution peu onéreuse, milieu similaire au futur brassin
      • Inconvénient : solution longue et complexe.

     

    A partir de reste de filtration d’un précédent brassin

    Lors d’un brassage, il reste le plus souvent une quantité non négligeable de sucre dans les drêches. On peut donc prolonger la filtration (jusqu’à ce que le liquide atteigne 1010 de densité) et récupérer puis conserver cette fin de filtration, soit en la congelant soit en la stérilisant comme décrit plus bas.

    Il ne faudra pas oublier de corriger la densité grâce à un ajout de sucre ou d’extrait de malt afin d’atteindre les 1040 cible.

    • Avantage : solution très économique, milieu proche du futur brassin
    • Inconvénient : nécessite de réfléchir en amont et de conserver du moût de filtration

     

     


    Conservation du moût

    Une fois le moût préparé il faut le conserver en vue d’une utilisation ultérieure. 3 solutions sont présentées ici : la réfrigération, la congélation et la stérilisation.

    Dans tous les cas le moût devra être porté à ébullition 20 minutes avant d’être placé dans le récipient qui le conservera.

    Réfrigération (uniquement si utilisation quelques jours après sa préparation)

    • Stériliser des contenants (bouteille en verres, flacons Schott, pot à confiture…) et un entonnoir, en versant de l’eau bouillante dedans (sans oublier le couvercle), attendre quelques minutes puis vider les bouteilles.
    • Transvaser le moût dans les récipients, fermer et mettre au frais.
    • Cette solution ne convient que pour une utilisation rapide et présente un risque non négligeable.

     

    Congélation

    • Stériliser des contenants (bouteille en verres, flacons Schott, pot à confiture…) et un entonnoir, en versant de l’eau bouillante dedans (sans oublier le couvercle), attendre quelques minutes puis vider les bouteilles
    • Transvaser le moût dans les récipients (en laissant quelques cm pour laisser le liquide se dilater, fermer et mettre au  congélateur.
    • Cette solution est plus durable mais nécessite un temps de décongélation avant utilisation. Il est en outre plus sécuritaire de refaire bouillir ce moût 20 minutes avant utilisation.

     

    Stérilisation avec cocotte-minute/autoclave

    • Mettre quelques centimètres d’eau au fond de la cocotte.
    • Disposer la solution dans des récipients autoclavables (flacons Schott, pots à confiture, bocaux style le parfait etc.) préalablement ébouillantés.
    • Mettre les récipients remplis de moût dans le panier de la cocotte
      • Si les récipients ont un joint qui permet un échange gazeux de l’intérieur vers l’extérieur (pots à confiture, bocaux le parfait etc.) les fermer complètement.
      • Si les récipients ont une fermeture hermétique (flacon Schott) les fermer à 80% et entourer le capuchon d’une feuille d’aluminium : pendant la stérilisation l’air dilaté pourra sortir du flacon sans le faire exploser et une fois le processus terminé on pourra les refermer sans toucher le capuchon (via l’aluminium).
    • Mettre la cocotte sur le feu et compter 20 minutes à partir du sifflement.
    • Attendre que la pression redescende naturellement, ouvrir la cocotte et visser éventuellement les capuchons sur les flacons hermétiques.

     

    Stérilisation sans cocotte-minute

    • Mettre ses récipients et leur couvercle (séparés) dans une marmite, les recouvrir d’eau et porter à ébullition 10 minutes.
    • Sortir les récipients à l’aide d’une pince sans toucher l’intérieur.
    • Verser le moût bouillant à l’intérieur et fermer hermétiquement.
    • Il est aussi possible dans le cas de récipients possédant un joint (pots à confitures, bocaux le parfait etc.) de les faire bouillir pleins recouvert d’eau pendant 30 minutes. Dans ce cas, il n’est pas nécessaire de stériliser les pots au préalable : les passer à l’eau bouillante suffit.

     

    Même s’il est plus prudent de la pratiquer, l’ébullition du moût avant utilisation n’est pas indispensable pour ces deux dernières méthodes. Il faudra par contre stériliser à la flamme le goulot des récipients.

     

     


    Comptage des levures au microscope

    Afin d’estimer précisément le nombre de cellules présent dans nos tubes la seule solution est de les compter au microscope.

    Le matériel

    • Un microscope : grossissement de 400X, oculaire grand champs (c’est mieux), binoculaire (c'est mieux) condenseur (c'est beaucoup mieux!) contraste de phase (Cool), Grossissement 60x (Extra!) 100X (Méga extra!!!)    Signé : Netzahualcóyotl
    • Du colorant vital (bleu Trypan, cancérigène, ou bleu de méthylène en solution à 0,1%)
    • Une cellule de comptage et sa lame de couverture

     

    Le principe

    • Prélever les levures (suivant la concentration initiale, il est plus commode d'effectuer une dilution pour un comptage plus facile)
      • Pour la dilution le plus simple est d’effectuer des dilutions d’un facteur 10 à chaque fois : prélevé un volume de levure et le dilué dans 9 volumes de solution isotonique.
      • La précision de la dilution devra être la plus exacte possible sous peine de fausser le résultat du comptage.
      • Répéter les dilutions jusqu’à obtenir une concentration cellulaire adaptée à notre lame de comptage. => l’objectif est d’avoir entre 20 et 50 cellules par unité de comptage.
    • Les mélanger volume à volume avec le colorant vital (le bleu Trypan comme le bleu de méthylène colore les cellules mortes)
    • Déposer une fraction de ce mélange sur une lame de comptage (Mallassez, Hémacytométre, Neubauer, Thoma…). Pour cela :
      • Nettoyer la lame de comptage et la lamelle de couverture
      • Mettre une microgouttelette d’eau sur chaque support de lamelle de la cellule de comptage et y placer la lamelle de couverture
      • Introduire quelques gouttes de la solution à observer via les pores d’introduction de la lame. La cellule va se remplir par capillarité : la solution ne doit pas déborder et remplir la totalité de la cellule. 
    • Compter à l'aide d'un microscope le nombre de cellules de levure non colorée par unité de quadrillage. Pour les cellules placées sur les côtés des carrés (à cheval sur une ligne), il ne faut prendre en compte que deux des quatre côtés (généralement le côté supérieur et le côté droit) afin de ne pas surestimer la population. Afin de lisser les marges d’erreurs, il faut prendre en compte plusieurs unités de quadrillage et faire une moyenne du nombre de cellule/unité de quadrillage.
    • Il est plus aisé d’avoir un papier avec un quadrillage vierge, l’optimal étant de pouvoir prendre un cliché via l’oculaire du microscope et d’effectuer le comptage sur un écran séparé. 
    • Calculer la concentration cellulaire par ml : cf. paragraphe suivant
    • En faisant le rapport nb de levures vivante (noncolorées)/nb de levures morte (colorées) on obtient le taux de viabilité de notre échantillon.

     

    Le calcul

    Pour retrouver la concentration, il faut procéder par étape.

    • Comme évoqué au point précédent il faut faire la moyenne du nombre de cellule par unité de quadrillage. Par exemple si on a compté 4 carrés à respectivement 28, 25, 27 et 26 cellules, nous avons en moyenne (28+25+27+26)/4 = 26.5 cellules par carré
    • Selon la lame de comptage utilisée, nous connaissons le volume d’un carré. Dans l’exemple d’une plaque de Neubauer, une grosse unité de quadrillage fait 0.1 μl. Nous avons donc sous les yeux 26,5 cellules/0,1μl soit 265 cellules/ μl
    • Il nous faut ensuite convertir en ml. 1ml = 103 μl. Nous avons donc une concentration de 265 000 cellules/ml
    • MAIS nous avons dilué nos cellules :
      • D’un facteur 2 lorsque nous les avons mélangé volume à volume avec le colorant
      • Et avant cela lorsque nous avons dilué notre échantillon. Admettons pour l’exemple que nous avions dilué trois fois avec à chaque fois un facteur de dilution de 10 c’est-à-dire avec un facteur de dilution final de 1000 :
      • Au final nous avons donc dilué notre échantillon 2000 fois (10*10*10*2). En conclusion nous avons dans notre tube 265 000*2000 = 530 000 000 cellules/ml

     

    La formule globale est donc :

    Concentration cellulaire = [nombre de cellules comptées*facteur de conversion pour passer du volume d’un carré à 1 ml*facteur de dilution] / [nombre de carrés comptés]

     

    Références

    Lectures diverses, discussion avec Nezahualcoyotl, forum etc.

    Cette page wiki est accessible en PDF ici : https://www.brassageamateur.com/forum/ltopic26214-444026.html#p444026


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