Infections ⇒ Infection à Bacillus

[pascal35]

Salut,
Pour le milieu de décongélation, je pense que le mieux c'est d'utiliser du moût de ton brassin précédent (avant l'ajout des levures et fermentation). C'est le milieu qui ressemblera le plus au milieu dans lequel les levures se développeront par la suite. Sinon tu peux utiliser le milieu YPD sans agar.
Par contre je ne suis pas sur que le meilleur moyen de conserver tes stock de levures soit un congélateur -20°C classique, un stockage en tube (slant ou stabs) ou en boite Pétri sur gélose (avec repiquage régulier), conservé à 4°C est peut-être plus adapté en absence d'un congélo -80°C.

Si tu ne connais pas ce site, y a des infos intéressantes : http://www.maltosefalcons.com/tech/yeas ... -practices

Un autre point, je trouve que tes pots de stockage sont un peu larges, donc plus de risques de conta sauf si tu as une hotte, fait plutôt des aliquotes en tubes 1,5ml.

[Nezahualcoyotl]

Salut,

Par contre je ne suis pas sur que le meilleur moyen de conserver tes stock de levures soit un congélateur -20°C classique

Ce n'est certes pas le meilleur moyen , surtout que nos congélateurs sont ouverts très/trop régulièrement et que suivant l'emplacement cela peut-être préjudiciable. Mais cela permet pour le moins de conserver ses souches au moins 3 à 4 ans ( sous réserve de les prélever comme déjà indiqué ).

Je suis par contre d'accord avec toi pour les pots, mais si en travaillant avec un bec bunzen correctement il ne devrait pas y avoir de problème de contamination.

Nezahualcoyotl

[St Pavin]

Tes quantités YPD sont pour 1 litre de solution ? Tu prends de l'eau "standard' ou déminéralisée ?
Pour ce qui est des pots, c'était histoire d'avoir suffisamment de levures survivantes pour ré-encemencer un "starter" de 50 ou 100 ml ; il faut savoir que ces pots sont stériles (jusqu'à l'ouverture en tout cas) et que je trouvais que c'était plus simple et faisait moins de manip pour les remplir (pas besoin de pipette, on verse direct). D'ailleurs, vaut-il mieux congeler les levures en suspension dans le starter ou attendre quelques jours qu'elles sédimentent afin de ne prendre que le "slurry" ??

[Nezahualcoyotl]

Tes quantités YPD sont pour 1 litre de solution ? Tu prends de l'eau "standard' ou déminéralisée ?
Pour ce qui est des pots, c'était histoire d'avoir suffisamment de levures survivantes pour ré-encemencer un "starter" de 50 ou 100 ml ; il faut savoir que ces pots sont stériles (jusqu'à l'ouverture en tout cas) et que je trouvais que c'était plus simple et faisait moins de manip pour les remplir (pas besoin de pipette, on verse direct). D'ailleurs, vaut-il mieux congeler les levures en suspension dans le starter ou attendre quelques jours qu'elles sédimentent afin de ne prendre que le "slurry" ??

Oui , c'est pour un litre. Quand je parle d'eau , il s'agit d'eau pure, mais tu peux utiliser de l'eau de conduite ( en équilibrant le pH) . Inutile de chercher à ensemencer un large volume dés la décongélation, un cycle de culture suffit à amplifier son volume.
Non, pour la congélation les levures doivent être dans l'état de fraicheur optimum.

Nezahualcoyotl

[pascal35]

Salut,

Par contre je ne suis pas sur que le meilleur moyen de conserver tes stock de levures soit un congélateur -20°C classique

Ce n'est certes pas le meilleur moyen , surtout que nos congélateurs sont ouverts très/trop régulièrement et que suivant l'emplacement cela peut-être préjudiciable. Mais cela permet pour le moins de conserver ses souches au moins 3 à 4 ans ( sous réserve de les prélever comme déjà indiqué ).

Je suis par contre d'accord avec toi pour les pots, mais si en travaillant avec un bec bunzen correctement il ne devrait pas y avoir de problème de contamination.

Nezahualcoyotl

Je pensais que le principal problème des congélateurs -20°C était la vitesse de congélation trop lente et la formation de cristaux de glace. Tu penses qu'il vaut mieux conserver les couches à -20°C avec glycérol qu'à 4°C sur gélose ? moins de mutations ?

[St Pavin]

Donc si j'ai bien compris pour résumer : Je mets dans mon gros pot un volume (ex 10 ml) de starter auquel je rajoute le même volume de solution YPD (10ml ici) puis je rajoute du Glycérol (30% de volume final ?? soit ici vol final environ 28ml (20ml/70%x100) donc 8ml de Glycérol) ; tout ça bien évidement avec une hygiène draconnienne ; ensuite dans l'idéal je plonge le pot dans l'azote puis à -80°C (chez moi directement à -22°C mais ce congélateur ne sert que pour la brasserie donc ouvert au max 1x/sem).
Des oublis ? des erreurs ??

[Nezahualcoyotl]

non, tu prends une culture fraiche en début de phase de croissance ( DO600nm < 0.4 , ou une colonie reprise dans 5 ml pour 24h de culture) ; tu prélèves eg 5 ml cette culture; tu la mélanges avec 5 ml de YPD-glycérol 30% v/v; tu obtiens 10 ml de levure à 15% glycérol que tu congèles ( idéalement en plusieurs tubes , contacte moi en MP ) à -20, -80 ou -196C suivant tes possibilités.
Tout cela proprement.

Je m’aperçois encore des limites de mes explications... J'avais, il y a quelques mois de cela trouvé un membre du forum vidéaste et nous nous étions posé la question de réaliser des courtes vidéos didactiques... Il est parti en stage en Ardèche...

Nezahualcoyotl

[St Pavin]

Je m’aperçois encore des limites de mes explications...

C'est pas pour insister mais le DO 600< 0,4 ne m'est pas hyper familier ... Le CFU déjà un peu plus familier (Colony Forming Unit) mais comme je vais continuer à utiliser mes gros pots (et donc congeler entre 10 et 40 ml) il me faut une estimation plus grossière


PS : à quand le livre "Levures" par le Coyote ?

[pascal35]

DO 600< 0,4, c'est la densité optique à 600nm, ça permet d'estimer la concentration en levure, il faut un spectrophotomètre pour la mesurer.
A DO=0.4 les levures sont en phase exponentielle de multiplication, si on attend trop elles passent en phase stationnaire puis dépérissent.

[kenypixel]

Effectivement, le tube renfermant les levures congelées, n'est pas décongelé. Tu grattes sa surface à l'aide d'un instrument stérile ( anse de platine, ou même cure-dent en bois autoclavé dans un bocal à confiture ) et tu plonges cela dans le milieu de culture ( idéalement tube de 15ml avec 3ml de milieu) tu mets à 30°C en agitation.

Je ne pense pas que ta culture présente un danger quelconque.

Nezahualcoyotl

Salut Christophe,
J'avais une question suite à tes explications.
J'ai donc les tubes que tu m'as fournis dans lesquels j'ai congelé mes levures.
Alors je gratte un peu à la surface des tubes, je laisse cela dans 3ml de solution de mout a 1020 densité (24h ?).
Mais ensuite est ce que je peux tremper mon oeil d'inoculation dans ces 3ml pour inoculer une boite de petri ?

Merci d'avance pour tes conseils !