Je profite de ma reprise des activités cellulaires pour faire une petite explication de mon process, si ça peut aider ceux qui s'y mettent. J'encourage aussi tous ceux que la partie levures intéresse à se procurer "Yeast" qui détaille l'aspect comptage mais aussi plein d'autres trucs. Mention spéciale au Coyote qui, en plus de m'avoir fourni des levures au top, m'a été d'une grande aide pour mettre en place mon process et comprendre certaines erreurs.
1) Le starter
Le matos :
- Erlenmeyer
- Agitateur magnétique avec son barreau aimanté
- Tubes ou flacons pour conserver un surplus
Je commence toujours par un starter, que ce soit avec un sachet neuf ou un tube en stock. En fonction du nombre de cellules nécessaires et de l'estimation de celles dont je dispose, je le fais éventuellement en deux étapes. Il y a des calculateurs bien connus pour évaluer le nombre de cellules nécessaires, comme Brewer's Friend.
Pour ceux qui veulent comprendre ce qu'il y a derrière ces calculateurs, c'est simple :
Nombre de cellules nécessaires (en millions) = Volume du brassin (en L) x Densité initiale (en degrés Plato) x ratio d'ensemencement (ou "pitching rate")
Pour passer de la densité sous forme 1,xxx à la densité en degrés Plato, une formule simplifiée est de faire xxx/4. Par exemple, pour 1,050 on obtient 50/4 = 12,5 °Plato.
Le ratio d'ensemencement est généralement pris égal à 0,75 pour les ale et 1,5 pour les lagers. Pour des densités élevées (>1,070) il est utile d'augmenter ce taux de 0,25 voire plus.
Exemple, pour un brassin d'ale de 20 L à 1,050 :
Nombre de cellules nécessaires = 20 x 12,5 x 0,75 = 180 millions de cellules.
Pour évaluer le nombre de cellules obtenues selon la taille du starter, sa densité et le mode d'agitation, c'est un peu plus compliqué mais en gros c'est une formule qui se base sur des résultats d'expérience effectuées soit par C.White soit par Braukeiser. Le plus simple est de se fier aux calculateur. Je peux partager un fichier excel avec les formules pour ceux que ça intéresse. Le plus fiable est de compter
Je sur-dimensionne toujours mon starter de manière à pouvoir conserver un surplus, soit dans un tube gradué de 50 mL (achetés stériles par lot de 100) soit dans un petit flacon en borosilicate de 250 mL, que je passe 20 min à la cocotte minute au préalable pour le stériliser. J'ai acheté ce petit matos sur labomoderne :
https://www.labomoderne.com/gamme.tubes ... X3991.html
https://www.labomoderne.com/gamme.flaco ... 14501.html
Il y a d'autres fournisseurs de petit matériel : conatex, lelaborantin, etc...
Je fais la plupart du temps des starters d'1L dans un erlenmeyer de 2L) ou de 2L (dans un erlenmeyer de 3L, mais attention à placer un bac de rétention en cas de gros krausen). J'utilise un agitateur magnétique, jusqu'à maintenant un INTLLAB acheté sur Aliexpress mais mort au bout d'un an, et à partir de maintenant un Vortex, fabriqué par une micro-entreprise belge montée récemment. Je ne suis pas bricoleur mais pour ceux qui sont plus à l'aise il y a plein de tutos pour en fabriquer maison à partir de ventilos de PC et d'aimants de disques durs.
Je fais la plupart du temps 24h d'agitation, puis 24h à 48h au repos. Lorsque les cellules ont suffisamment flocculé, je considère que c'est ok. Je vide le surnageant de manière à avoir en gros 1/3 de slurry et 2/3 de surnageant, puis j'homogenéise le tout et je me mets de côté un petit volume en tube/flacon.
Ce surplus me permettra de pérenniser une banque de levures, conservée au frigo, dans laquelle j'irai piocher pour les futurs starters.
Le reste du starter ira dans le brassin.
2) Le comptage et le test de viabilité
Matériel :
- Microscope utilisé sur le réglage x400
- Cellule de comptage (Malassez)
- Petits tubes 8 mL sur leur rack
- Micropipettes 100-1000 microlitres et pointes stériles
- Bleu de méthylène
J'ai donc quelques tubes ou flacons, étiquetés et datés, au frigo. Au moment de réutiliser une levure, ça fait généralement plusieurs mois qu'elle attend, je ne connais pas précisément le nombre de cellules contenues dans le récipient et je n'ai à ce moment aucune certitude sur la viabilité de ce stock (proportion de levures en vie).
Je vais donc faire mon comptage et un test de viabilité en même temps.
Je commence par agiter le tube/flacon énergiquement pour bien homogénéiser le contenu. Puis je prélève 0,1 mL avec la micropipette. Pour m'assurer que les pointes sont stériles je les ai passées 20 min à la cocotte, par batch de plusieurs dizaines dans un petit bocal, puis conservées dans ce même bocal bien fermé. On peut aussi les acheter directement stériles et sur rack.
Je dépose ces 0,1 mL dans un petit tube 8 mL, puis je complète avec 5,9 mL d'eau pour atteindre un volume de 6 mL. À ce stade la dilution est donc de 6/0,1 = 60. C'est généralement trop peu pour que les cellules soient au final suffisamment espacées pour permettre un bon comptage. Je fais donc une deuxième dilution de manière à atteindre par exemple 120, en prélevant 1 mL de solution déposées dans un 2e petit tube et en ajoutant 1 mL d'eau. Ce facteur de dilution fonctionne bien la plupart du temps, mais selon les souches et la concentration de levures dans le tube il faut parfois diluer plus ou moins et donc y aller un peu au tâtonnement. A noter qu'avec des tubes de plus grandes contenances on pourrait s'éviter la double dilution en faisant direct une dilution de 0,1 mL de levures dans 11,9 mL d'eau.
Il faut maintenant ajouter le bleu de méthylène, qui va pénétrer dans les cellules mortes et les colorer. Je prélève 0,1 mL de solution diluée, que je dépose dans un 3e petit tube, et j'ajoute 0,1 mL de bleu de méthylène. J'ai donc à nouveau multiplié le facteur de dilution par deux, j'atteins 240 dans cet exemple. Je ferme le tube et le secoué vigoureusement, puis j'attends 1 ou 2 minutes.
Je prélève ensuite un petit volume (peu importe tant que c'est supérieur à la contenance de la cellule de comptage qui est de 0,01 mL) que je viens déposer sur la cellule de comptage, en glissant le liquide entre la cellule et une plaquette déposée dessus.
Ça y est, on peut observer !
On voit des grilles de 5x4 carrés, dans lesquels se trouvent nos cellules. Les blanches sont les vivantes et les bleues sont les mortes.
Voilà une illustration, sur ma première observation d'une recup de fond de fermenteur de WLP550 de mémoire. Désolé l'exemple n'est pas top car ici les cellules sont un peu trop concentrées pour pouvoir bien les compter et il y a d'autres trucs que des levures, mais j'ai pas d'autres images sous la main. Celles-ci avaient pris cher en plus en terme de viabilité (fond de brassin bien alcoolisé).
Les méthodes de comptage sont expliquées sur internet. Personnellement je procède de cette manière : je compte toutes les cellules qui se situent dans 5 grilles prises au hasard en comptant également combien sont mortes. Pour déterminer la viabilité c'est assez simple il suffit de faire la moyenne du ratio "cellules vivantes / toutes les cellules".
Pour compter le nombre total de cellules dans le tube il faut extrapoler en considérant qu'une grille = 0,01 microlitre. Je me suis fait un fichier excel pour me faire le calcul automatiquement, je ne l'ai pas sous la main ce week-end mais je pourrai le partager par la suite. Bien sûr il faut tenir compte dans ses calculs du facteur de dilution pour remonter à la concentration de son tube en milliards de cellules / mL. On multiplie ensuite par le volume de son tube et par le taux de viabilité, et on obtient le nombre total de cellules vivantes dans son stock.
Ce qui permet de dimensionner son starter... et ainsi de suite
Au début ça fait un peu cogiter mais une fois qu'on prend en main le processus ça va relativement vite.
Il y a aussi la possibilité de lancer un starter "au pif" et de compter le résultat, ou encore de compter avant et après le starter.
3) Faut-il compter / tester la viabilité ?
Si vous n'avez pas de temps à consacrer a cet aspect du brassage, je pense que le mieux est d'acheter des sachets neufs à chaque brassin.
Si vous souhaitez commencer à réutiliser les levures, mais que vous voulez garder les choses simples, alors vous pouvez par exemple considérer une hypothèse d'environ 2 milliards de cellules / mL de slurry (moyenne basse de mes comptages pour des slurrys issus de starters) et dimensionner vos starters en conséquence. Le problème est que d'une souche à l'autre cette valeur peut aller de 1 à 10 donc le taux d'ensemencement ne sera jamais vraiment maîtrisé. Vous n'aurez pas non plus d'infos sur la viabilité des levures, ce qui peut être un peu stressant lorsqu'on ressort un tube qui date de l'année d'avant.
Si vous souhaitez pouvoir maîtriser précisément votre taux d'ensemencement, connaître l'état de vos stocks en nombre de cellules et en viabilité, et éventuellement adapter le dimensionnement de vos starters à vos observations (plutôt que de vous fier uniquement aux calculateurs), alors l'étape comptage / viabilité est importante.
Dans tous les cas ce process doit rester un plaisir, comme le reste du brassage lorsqu'on le pratique en amateur, et c'est à chacun de voir selon ses intérêts
