Salut à tous,
Je m'apprête à stocker différentes souches de levures d'une part sur gélose en boite de Petri, et d'autre part congelé en solution de glycerol.
Après avoir passé plusieurs semaines à éplucher ce forum, différents sites et bouquins, j'ai regroupé, condensé et développé le tout et je me suis fait des petites fiches de travail précises et détaillée de chaque étape. Le tout adapté à un labo DIY de cuisine.
La première fiche porte sur la culture de levure sur gélose.
Objectif: conserver indéfiniment (en repiquant tt les mois) ses souches de levures dans des boites de Petri conservées au frigo.
Histoire d'éviter à ceux qui aurait la mme intention ce pénible travail de recherche (c'est bête mais on oublis toujours de préciser tel ou tel détail quand on parle de ce qu'on connaît, et pour le novice c'est des heures de recherches pour retrouver l'information manquante), je vous envois cette fiche de travail que j'ai au mieux essayée de rédiger pour qu'elle soit compréhensible à celui qui n'y connaît rien de rien (bien sur on peut toujours aller plus loin dans la simplification, mais là je pense que j'ai déjà fait dans le très simple, pour le reste demandez à google
).Je vous invite bien entendu, surtout si vous avez de l'expérience dans le domaine, à commenter ou corriger les différents passages, afin d'enrichir la chose de votre expérience.
Nettoyage, stérilisation, méthodologie générale
Doit être appliqué pour chaque séance de travail
S'assurer que le plan de travail soit bien horizontal (niveau à bulle)
Passer tous les ustensiles à l'autocuiseur (cocotte minute):
Mettre 1 à 2 cm d'eau au fond de l'autocuiseur
Disposer tous le matériel dans le panier pour cuisson vapeur
Envelopper le petit matériel (boite petri, etc) dans du papier alu
Les flacons doivent être bouchés sommairement et non hermétiquement
Fermer cocotte et faire chauffer. Laisser chauffer au moins 20 minutes après la rotation de la
Nettoyer plan de travail à l'alcool à 70 (attention l'alcool est très inflammable).
Poser une couche de papier aluminium sur le plan de travail
Passer un coup d'alcool à 70 sur ce film
ATTENDRE QUE L'ALCOOL SOIT TOTALLEMENT EVAPORE POUR ALLUMER LE BEC BUNSEN
Se laver soigneusement les mains, passer un coup de brosse sous les ongles.
Se frictionner les mains à l'alcool et laisser sécher.
Positionner tout ce qu'on aura besoin sur le plan de travail afin d'éviter mouvement inutiles.
Portez un masque et évitez de parler ou de faire des mouvement brusques ou de provoquer des courants d'air
Limitez au minimum le temps d'ouverture de tous les contenants
Allumer le bec bunsen et laissez le allumé tout au long des préparations
Celà créer une zone stérile dans un cercle de 20cm autour de la flamme
Toutes les opérations doivent être faites dans cette zone
Préparation de la gélose:
Préparation de la gélose qui sera utilisée comme support aux colonies de levures
Nettoyer l'environnement de travail et les ustensile comme indiqué dans "Nettoyage, stérilisation, méthodologie générale"
Nous aurons besoin de mout, soit prélevé lors d'un précédent brassage, soit brassé à cet effet, soit préparé avec de l'extrait de mout.
La densité du mout à utilisé à 20 degré doit être d'environ 1040
Si pas assez dense rajouter du sucre pour atteindre 1040
Si trop dense diluer avec de l'eau pour atteindre 1040
Mélanger entre 20 et 50g d'agar dans un litre de ce mout
Transvaser dans différents récipients, l'un devant permettre de préparer les boites que nous allons utiliser, les autres permettant de conserver sa solution de gélose pour les futurs repiquage.
Mettre un fond d'eau (1 à 2cm) dans l'autocuiseur.
Placer les récipients contenant l'agar dans l'autocuiseur.
Les bouchons posés mais légèrement ouverts.
Placer une feuille de papier alu sur bouchons et cols des récipients.
Faire chauffer et conserver 20min après la rotation de la soupape.
Laisser refroidir lentement dans l'autocuiseur.
Ouvrir l'autocuiseur et fermer les bouchons.
Garder qq pots de gélose pour le futur, conservation à température ambiante.
Préparation des boites de Petri
Préparation des boites de Petri dans lesquelles les levures seront cultivées et conservées (1 mois au frais)
Nettoyer l'environnement de travail et les ustensiles comme indiqué dans "Nettoyage, stérilisation, méthodologie générale"
Ouvrir légèrement le bouchon d'un boite stérile contenant la gélose
Placer la boite dans un bain marie et chauffer jusqu'a liquéfaction de la gélose
La gélose doit avoir dans les 65 degré.
Allumer bec bunzen à petit foyer (Bleuet)
Disposer les boites de pétri dans un rayon de 20cm autour de la flamme
Toutes les manipulations doivent s'effectuer dans cette zone.
Prenez un pot de gélose avec un gant et verser les boites de petri
La couche de gelose doit avoir une epaisseur de 5mm et etre bien horizontale
Poser les couvercles sur les boites et laisser refroidir
Une fois refroidie passer rapidement la gélose à la flamme
Dessécher à la flamme l'excès éventuel d'humidité qui peut se trouver dans les couvercles
Si on veut conserver des boites de gélose pour une utilisation future, les fermer avec du sparadrap stérile et les mettre au réfrigérateur à l'envers (gélose en haut).
Ensemencement
Nettoyer, stériliser, etc, (voir "Nettoyage, stérilisation, méthodologie générale")
Allumer le bec bunsen
Placer les boites de petri dans une zone à moins de 20cm du bec et les ouvrir
Passez l'ose d inoculation à la flamme
Attendre qu'elle refroidisse (sans la sortir de la zone stérile de 20cm)
Plonger l'ose dans l'échantillon de levure liquide à cultiver, mis précédemment à fermenter, pour extraire une goute la plus petite possible
Faire un étalement: ensemencer la gélose en frôlant la surface selon la méthode des cadrans en prenant soin de passer l'ose à la flamme entre chaque rotation de la boite
(Méthode des cadrans, voir: http://www.didier-pol.net/3isol.htm)
Fermer les boites de petri et sceller avec un sparadrap sur le pourtour
Laisser les boites à une température entre 20 et 30 degré pendant qq jours et surveiller constamment l'apparition des colonies
Une bonne inoculation provoque des colonies totalement séparées
Dans le cas ou des colonies auraient des aspect ou couleurs différents des autres, il y'a contamination, jeter l'agar de la boite et stériliser le tout.
Si certaines colonies de la boites sont totallement isolées et semblent saines il est possible de les repiquer pour ensemencer une nouvelle boite de petri.
Quand les colonies atteignent une bonne taille (dans les 1 ou 1,5 mm) placer les boites au frigo tête en bas (couvercle en bas)
Les cellules se conservent ainsi entre 1 et deux mois
Repiquage des levures (tous les mois)
Bien qu'elles puissent éventuellement être conservées plus longuement avec suces il est conseillé de repiquer tous les mois ses levures conservées.
Sortir du frigo une boite de petri contenant la levure à repiquer ainsi qu'une boite de petri contenant une couche d'agar vierge
(ou en préparer une comme indiqué précédemment) laisser passer à température ambiante
Préparer l'environnement et stériliser le matériel (voir "Nettoyage, stérilisation, méthodologie générale")
Remplir un tube à essais avec 5ml de sérum physiologique stérilisé
Passer l'ose à la flamme et laisser refroidir
Prélever qq colonies dans la boite source à l'aide de l'ose
Mettre les colonies en suspension dans le tube
Passer l'ose à la flamme et laisser refroidir
Prendre une goutte de suspension de levure à l'aide de l'ose
Faire un étalement: ensemencer la gélose en frôlant la surface selon la méthode des cadrans en prenant soin de passer l'ose à la flamme entre chaque rotation de la boite
(Méthode des cadrans, voir: http://www.didier-pol.net/3isol.htm)
Fermer les boites de petri et sceller avec un sparadrap sur le pourtour
Laisser les boites à une température entre 20 et 30 degré (selon levures) pendant qq jours et surveiller constamment l'apparition des colonies
Une bonne inoculation provoque des colonies totalement séparées
Dans le cas ou des colonies auraient des aspect ou couleurs différents des autres, il y'a contamination, jeter l'agar de la boite et stériliser le tout.
Si certaines colonies de la boites sont totalement isolées et semblent saines il est possible de les repiquer pour ensemencer une nouvelle boite de petri.
Quand les colonies atteignent une bonne taille (dans les 1 ou 1,5 mm) placer les boites au frigo tête en bas (couvercle en bas)
Les cellules se conservent ainsi entre un et deux mois
Quelques sources (en ligne):
ICI:
viewtopic.php?f=52&t=6480&p=70500&hilit=levure+liquide+conserver#p70492
viewtopic.php?f=52&t=4335&hilit=levure+liquide+conserver
viewtopic.php?f=52&t=3343&start=0&hilit=levure+liquide+conserver
viewtopic.php?f=52&t=2635&start=0&hilit=levure+liquide+conserver
viewtopic.php?f=52&t=1300&start=0&hilit=levure+liquide+conserver
viewtopic.php?f=52&t=6480&start=10&hilit=glyc%C3%A9rol
ftopic143.html
ftopic7234.html
AILLEURS:
http://jg-laurent.com/levure/culture_levures.php
http://jg-laurent.com/levure/preparation_levures.php
http://www.svt.ac-aix-marseille.fr/labo ... article279
http://biotech.spip.ac-rouen.fr/spip.php?article56
http://www.didier-pol.net/2asepsie.htm
http://www.liddil.com/beer/culture/culture.html
