Les levures ⇒ Culture de levures - matériel et protocoles

[Adhafera]

Bonjour à tous,

J'ouvre encore un topic sur la culture de levures.
J'ai épluché pas mal de topics à ce sujet sur le forum (il m'en reste encore à parcourir) et je commence à bien avoir en tête les différentes méthodes et les protocoles associés.
Néanmoins, il me reste un ensemble de questions dont je n'ai pas encore trouvé la réponse.
Je viens donc vous les poser ici en espérant qui vous serez de bon conseils


1) Comment effectuer des prélèvements de 1 à 10ml en conditions de stérilité ?
J'ai trouvé des trucs de types seringues, pipettes pasteur en plastique (polyéthylène) ou en verre à usage unique. Le soucis c'est que c'est du matériel non stérile et le plastique, je ne sais pas s'il supporte une stérilisation en cocotte minute à120°C...

Sinon, j'ai déjà un peu de matos dont des pipeteurs et des pipettes graduées en verre. Ces pipettes peuvent se stériliser sans problème, mais le soucis c'est que ces pipettes sont trop longues pour rentrer dans ma cocotte minute ; arg !!! Donc pas moyen de les stériliser correctement.

Si vous avez une idée ou un conseil, je suis preneur ; quel matos utilisez-vous ?


2) Congeler ses levures au glycérol - avec du moût ou avec une solution isotonique ?
Ici, j'ai lu sur pas mal de topics que l'on pouvait conserver ses levures au frigo dans une solution isotonique 1 ou 2 ans. Ou alors au congélateur dans une solution à base de glycérol (~15% du volume total pour -20°C) et de moût.

Ma question est : est-il possible de congeler dans une solution isotonique + glycérol ? Pourquoi mettre du moût sachant qu'au congélo l'activité des levures est stoppée ? Je ne comprend pas la logique de l'opération.


3) Conservation ad vitam eternam dans de l'eau distillée à température ambiante
J'ai lu sur ce topic qu'il était possible de simplement conserver ses levures dans de l'eau distillé à température ambiante pendant plusieurs années !!

Plusieurs choses m'interpellent : le mélange eau + levure crée une réaction osmotique qui peut nuire à cette dernière non ? C'est pour ça qu'on utilise une solution isotonique pour reproduire un équilibre entre les milieux intra et extra cellulaires. Sauf que j'ai lu dans le même topic que la conservation de levure au frigo en solution isotonique ne pouvait ce faire que pendant 1 ou 2 ans. Du coup je trouve tout ça contradictoire et assez obscur... Il y a sûrement un protocole précis à respecter pour conserver ses levures dans de l'eau distillé à température ambiante (avec des volumes précis et sûrement très petit je suppose ?). Je n'ai pas réussi à trouvé le papier qui parle de ça. Si quelqu'un à une explication, je suis preneur !


Je n'ai plus que ces quelques points à éclaircir et je pourrai (enfin) me lancer dans le test de mes protocoles et commencer une belle petite banque de levures !

[Jinac]

Hello !

Alors pour le prélèvement : perso je passe à la flamme une pipette graduée en verre, on se fout un peu que ce soit "stérile" tout le long, seule la partie immergée dans ta culture doit l'être (avec une bonne marge de sécurité) donc quelques secondes à la flamme, t'attend un peu que ça refroidisse dans le champ de la flamme et hop. En tout cas c'est comme ça que je procède.

Pour la conservation au congel c'est bien en solution isotonique + glycerol, je sais pas où tu as vu mout (j'ai fait un fichier pdf sur la récup et la conservation de levure sur le post "recupératioN....) il est sur le wiki également

Enfin, sur le topic que tu cites, ça semble être en effet "prometteur" mais ça oblige à faire un plusieur starter (ou mieux repartir sur gelose) car la mortalité doit être assez forte

[Adhafera]

Salut Jinac, merci pour ton retour rapide :p

Alors pour le prélèvement : perso je passe à la flamme une pipette graduée en verre, on se fout un peu que ce soit "stérile" tout le long, seule la partie immergée dans ta culture doit l'être (avec une bonne marge de sécurité) donc quelques secondes à la flamme, t'attend un peu que ça refroidisse dans le champ de la flamme et hop. En tout cas c'est comme ça que je procède.

Juste passer à la flamme c'est suffisant ??
Donc en gros, je peux le passer à l'eau bouillante à pression atm quelques dizaines de minutes puis passer à la flamme l'extérieur lors de l'utilisation.
Mais du coup l'intérieur ne sera pas forcement bien stérilisé ?

Dans l'idée, j'aimerai garder des flacons de 100ml aux frigos en solution isotonique et prélever 2 à 5ml dans ces flacons régulièrement pour lancer mes starters. Du coup ça veut dire que je vais potentiellement utiliser plein de fois ma pipette pour venir prélever dans le même flacon à des intervalles de temps réguliers. Donc si la pipette n'est pas tout à fait stérile, ça risque de contaminer le flacon.

D'après toi, dans ce cas là, le passage à la flamme est suffisant ? (EDIT : d'autant plus que je n'ai pas de bec bunsen, mais une simple lampe à alcool)

Pour la conservation au congel c'est bien en solution isotonique + glycerol, je sais pas où tu as vu mout (j'ai fait un fichier pdf sur la récup et la conservation de levure sur le post "recupératioN....) il est sur le wiki également

Ah oui, en effet. Je l'ai lu en plus cet excellent article ! (merci pour ta contrib !) Mais j'ai du m'embrouiller avec les divers topics sur le forum. La plupart du temps je lis de diluer le "milieu de culture" avec du glycérol avant d'ajouter les levures. Mais maintenant que tu le dis, je me rend compte que le milieu de culture, ce n'est pas obligatoirement du moût, mais que ça peut très bien être une solution isotonique...

Enfin, sur le topic que tu cites, ça semble être en effet "prometteur" mais ça oblige à faire un plusieur starter (ou mieux repartir sur gelose) car la mortalité doit être assez forte

Ah ok, donc plus compliqué à récupérer et à relancer.

[Jinac]

Pardon je pensais que tu parlais du prélèvement sur starter pour comptage... Quoi qu'il en soit, faudrait demander confirmation à un biologiste, mais passer une pipette a la flamme, ça fait monter sa température assez haut, je sais pas si on peut considérer que c'est stérile mais pour prélever dans un starter je pense que ça le fait. Dans un tube peut-être aussi, faut demander à des gens compétent.
Pour les tubes, j'utilise une seringue (pas stérile) et des aiguilles neuves (stériles)

[goulven]

Quoi qu'il en soit, faudrait demander confirmation à un biologiste, mais passer une pipette a la flamme, ça fait monter sa température assez haut, je sais pas si on peut considérer que c'est stérile mais pour prélever dans un starter je pense que ça le fait. Dans un tube peut-être aussi, faut demander à des gens compétent.
Pour les tubes, j'utilise une seringue (pas stérile) et des aiguilles neuves (stériles)

Les pipettes ça va a l'autocalve normalement, si tu veut travailler stérile facilement il vaut mieux prendre des tips déjà stérile avec une micropipette. Bon je dis ça mais je ne suis pas microbiologiste…

1) Comment effectuer des prélèvements de 1 à 10ml en conditions de stérilité ?

En fait dans l'absolu, le milieu de prélèvement n'étant pas stérile (si c'est de ton fermenteur que tu parles), ce que tu cherches, c'est d'éviter de contaminer ton prélèvement. Le mieux dans ce cas est de partir sur gélose et de sélectionner. A partir de là, tu pourra être stérile si tu travailles sous flamme et avec tout l'équipement stérilisé.

2) Congeler ses levures au glycérol - avec du moût ou avec une solution isotonique ?

Ni l'un ni l'autre, H2O(eau distillée)+ glycérol.

Il y a sûrement un protocole précis à respecter pour conserver ses levures dans de l'eau distillé à température ambiante (avec des volumes précis et sûrement très petit je suppose ?). Je n'ai pas réussi à trouvé le papier qui parle de ça. Si quelqu'un à une explication, je suis preneur !

Je n'ai jamais essayé cette méthode, mais je peut être sûr d'une chose, c'est qu'il faut bien séparer la levure de son milieu pour le faire et pour être sûr qu'il n'y ai que H2O et levure.

[Jinac]

Ni l'un ni l'autre, H2O(eau distillée)+ glycérol.

gloups en effet, lapsus de ma part, j'ai mis "solution isotonique" au lieu de "eau stérilisée"

[Adhafera]

Merci à vous deux.

Les pipettes ça va a l'autocalve normalement

Mes pipettes graduées en verre oui, sauf que ma cocotte minute est trop petite ! (les pipettes font 30cm de long !)
Les micropipettes, c'est assez cher et comme j'ai déjà des pipettes graduées en verre à dispo, j'aimerai trouver un moyen de les stériliser.
Le passage au four pour une stérilisation sèche m'embête car je n'ai pas envie de laisser le four tourner 1h pour 3 pipettes...

1) Comment effectuer des prélèvements de 1 à 10ml en conditions de stérilité ?

En fait dans l'absolu, le milieu de prélèvement n'étant pas stérile (si c'est de ton fermenteur que tu parles), ce que tu cherches, c'est d'éviter de contaminer ton prélèvement.

Si justement, je souhaite prélever régulièrement dans un flacon stérile contenant des levures dans une solution isotonique stérile.
Le but c'est de garder le flacon au frigo, de prélever à chaque fois que je veux faire un starter pour un brassin (sans repasser par l'étape gélose).
Et quand le flacon est vide (ou que les levures sont mortes), je gratte mes tubes congelés => géloses => mini starter => flacon isotonique => c'est reparti pour un an.

2) Congeler ses levures au glycérol - avec du moût ou avec une solution isotonique ?

Ni l'un ni l'autre, H2O(eau distillée)+ glycérol.

Ah, et y a-t-il une raison d'utiliser dans ce cas de l'eau distillée ? quid du phénomène d'osmose ?

[Adhafera]

Ah oui, une autre question qui me revient : j'aimerai préparer des boites de géloses à l'avance.
Pour ça, je stérilise à la cocotte mes boites de pétris (en verre), ma gélose (dans un erlen).
Lorsque la gélose (mout + agar) est à environ 60°C, je verse dans mes boites.

Pour les stocker, j'ai lu qu'il fallait les entourer de sparadrap type électricien. Ce sparadrap ne peut donc pas être stérile. Est-ce grave ? Ou alors il faut un sparadrap spécial ?

[F6EEQ]

Je n'y connais rien en levures, ou très peu, mais un peu en biochimie.

La gélose c'est de "la merde" en ce sens que c'est, par essence, un substrat de culture. Même stérilisé, c'est très très sujet à contamination.
Donc les garder plus de quelques heures, ou quelques jours au grand maximum c'est presque de l'utopie...

Maintenant, ce n'est que mon avis, je n'ai pas vraiment d'expérience.

[Adhafera]

Je n'y connais rien en levures, ou très peu, mais un peu en biochimie.

La gélose c'est de "la merde" en ce sens que c'est, par essence, un substrat de culture. Même stérilisé, c'est très très sujet à contamination.
Donc les garder plus de quelques heures, ou quelques jours au grand maximum c'est presque de l'utopie...

Maintenant, ce n'est que mon avis, je n'ai pas vraiment d'expérience.

Merci pour ce retour. Donc d'après toi, difficile de préparer ses boites à l'avance et de les utiliser le moment venu ?
En tout cas je me suis lancé dans quelques tests ce matin. On verra bien combien de temps les boites tiennent.