Les levuresCulture de levures - matériel et protocoles

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Jinac
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Re: Culture de levures - matériel et protocoles

Message par Jinac »

euh... alors dans ma vision, le problème du condensat était de fausser le volume de prélèvement de la micropipette, et donc de fausser le comptage (je voyais ça toujours pour du comptage).

Pour ce qui est de la possible infection, ça n'a à mon sens pas trop lieu d'être puisque les tips sortent de la cocotte (donc plutôt stérile, même le condensat) et sont utilisés quasiment instantanément.

Par contre sur un tips de 50 microL, un peu de condensation ça fait vite beaucoup d'erreur non ?

shonight a écrit :Je me permet juste une question, lbc c'est l'acronyme de quoi?
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Re: Culture de levures - matériel et protocoles

Message par shonight »

ohh my bad, j'avais lu un peu vite et pas vu que tu voulais faire du comptage ^^. Ben si tu compte à l'hémocytomètre, ouais je dirais que rincer ta pipette ça passe sans problème, au final, on change pas de tips entre chaque manip non plus, seulement si on change de solution pour pas contaminer.

(LeBoncoin.. dire que j'ai cherché des noms de site de brassage et de matériel de labo haha, j'oublie toujours que leBonCoin existe ^^)
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Adhafera
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Re: Culture de levures - matériel et protocoles

Message par Adhafera »

Merci beaucoup à tout le monde pour vos retours/remarques et conseils. Ça m'a permis d'y voir plus clair. Je vais finalement craquer pour une micropipette DLab 100-1000µL, ça sera plus simple pour les manips.

Du coup, j'ai pu terminer de rédiger la première version de mes fiches de process. C'est un peu redondant avec l'article de Jinac qui est sur le wiki, mais j'avais besoin de rédiger ça à ma sauce en prenant en compte mon matos et la manière dont je souhaite travailler.
2020-05-10_micro_biologie_protocoles.pdf
Dans le doc, les points en rouge sont les points de doute. Il n'y a pas grand chose et c'est souvent du détail :
  • Pour fermer les boites de pétri, du sparadrap stérile qu'on trouve en pharmacie est-il bien adapté ? (ce n'est pas étanche : mal ?)
  • Faut-il fermer avec ce même sparadrap les boite de pétri avec une culture dessus (ce n'est pas étanche : bien ?)
  • J'ai trouvé quelques infos contradictoires sur les quantités équivalentes de DME ou d'extrait liquide par rapport au sucre classique. J'ai retenu pour le moment DME = 1.25 x sucre et extrait liquide = 1.6 x sucre. Mais une simple recherche me permettra de valider ou non ces chiffres.
  • Pour la congélation des micro-tube, on peut les passer directement à -20°C ou faut-il les refroidir au frigo, remettre les levures en suspensions puis seulement après les mettre au congélo
  • Pour préparer le fond de levure qui servira à être congelé, il faut laver avec une solution isotonique ou avec de l'eau distillé (sachant que la solution glycérolée est faite avec de l'eau distillée)
  • Pour prélever les 2mL levures du tube conservé à +4°C, faut-il remettre les levures en suspension ?
Ça reste une version 0. Il me faut maintenant tester tout ça et valider la faisabilité :)
A bientôt.

EDIT : nouvelle version après une passe de correction de fautes de langue grossières...
Vous ne pouvez pas consulter les pièces jointes insérées à ce message.
Tests concluants : Bière, Bière sauvage, Hydromel, Saké japonais, Miso, Koji, Champignons comestibles, Fromages (type St-Marcelin et Maroille), Kéfir de lait, Lacto-fermentation (Kimchi, choucroute, Ketchup de carotte), Levain, Vinaigre
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Re: Culture de levures - matériel et protocoles

Message par shonight »

Alors j'ai eu des réponses pour la stérilisation des pointes de tips. Même si une stérilisation à 121°C pendant 20 min est sensé tuer 99.99% des microorganismes, le condensat reste un problème. En fait, pendant que l'eau du condensat refroidit, elle devient un milieu intéressant pour des spores bactériens (genre Bacillus et avoir des bacillus dans sa bière c'est pas forcément cool (même si ça se voit vite dans la boite de pétri ^^). L'idée ça serait qu'il faut se débarrasser le plus vite possible de cette eau. Ce qu'on m'a proposé, c'est de passer la boîte de tips encore chaude (donc sortant de la marmite à pression) au four à environ 100°C, juste assez pour évaporer le condensat. Normalement si elle a tenu les 121°C de la marmite à pression elle devrait tenir les 100°C du four. Ou une autre solution serait de surélever la boîte de tips pendant la stérilisation à la vapeur, en gros ne pas l'avoir au fond de la marmite à pression (là je saurais pas dire pourquoi ça aiderait).

Perso si je devais avoir un choix entre les deux je me pencherais vers le passage en four. voilà en espérant que ça peut aider :)
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Re: Culture de levures - matériel et protocoles

Message par Nezahualcoyotl »

shonight a écrit :Alors j'ai eu des réponses pour la stérilisation des pointes de tips. Même si une stérilisation à 121°C pendant 20 min est sensé tuer 99.99% des microorganismes, le condensat reste un problème. En fait, pendant que l'eau du condensat refroidit, elle devient un milieu intéressant pour des spores bactériens (genre Bacillus et avoir des bacillus dans sa bière c'est pas forcément cool (même si ça se voit vite dans la boite de pétri ^^). L'idée ça serait qu'il faut se débarrasser le plus vite possible de cette eau. Ce qu'on m'a proposé, c'est de passer la boîte de tips encore chaude (donc sortant de la marmite à pression) au four à environ 100°C, juste assez pour évaporer le condensat. Normalement si elle a tenu les 121°C de la marmite à pression elle devrait tenir les 100°C du four. Ou une autre solution serait de surélever la boîte de tips pendant la stérilisation à la vapeur, en gros ne pas l'avoir au fond de la marmite à pression (là je saurais pas dire pourquoi ça aiderait).

Perso si je devais avoir un choix entre les deux je me pencherais vers le passage en four. voilà en espérant que ça peut aider :)
C'est pourquoi sur les autoclaves modernes, tu as un cycle de purge. Cela fait longtemps que je ne vois plus de condensat sur les boites de cônes qui me reviennent de l'autoclave.
Maintenant, en amateur, avec notre stérilisation à l'aide d'un autocuiseur, ou lors de la préparation de nos boites de gélose, nous aurons des gouttes de condensat sur les couvercles, généralement. Ce que nous faisions , lorsque nous rencontrions ce soucis ( l'eau du condensat est stérile, mais c'est une gêne car elle risque de tomber sur la gélose et de disperser les colonies, de mouiller les cônes, etc etc ... ) , nous ouvrions la boite sous le bec Bunsen et l'eau s'évaporait ainsi ( plutard, nous le faisions sous le PSM ) .

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Re: Culture de levures - matériel et protocoles

Message par Dub »

Bonjour,
je remet en route ce topic, car ce sujet me passionne et je pense cultiver mes levures dans les semaines qui arrivent. Je vois à peu près comment je vais faire grâce à toutes les informations précédentes (un grand merci, car franchement les infos de qualité sur ce sujet ne sont pas si courantes):
-récolte en fond de fermenteur
-nettoyages à la solution isotonique
-mise en conservation grâce à la glycérine
-congélation.
pour l’utilisation:
-réalisation d'un starter de 2 litres grâce à à un rinçage+sucre (pour atteindre à 1040 de densité)
-ensemencement avec 25% du starter
-lavage des 75% restant
-mise en conservation,etc...

Je ne pense pas compter les levures car.....un microscope ça coute, ça prend du temps, et c'est chiant. :roll:

J'ai quelques questions à ceux qui ont l'habitude de faire cela:
-vous est-il arrivé d'avoir un gout de levure trop prononcé (car trop de levures)? :cry:
-les quantités vous semblent-elles cohérentes (0,5 litres de starter pour ensemencer 25 litres de mout) :clap:
-comment peut-on détecter une pollution avec une levure sauvage (avant l'ensemencement)?
-comment savoir si le starter est prêt (mesure densité je suppose)?
-votre expérience permet-elle de dire que l'on peut faire cela à l'infini, en restant en mode 'amateur'?
-avec le temps, vous avez acquis de l'expérience sur ce sujet, avez-vous de nouveaux conseils? :think:


Merci pour vos conseils, vos remarques constructives, et retour d'expérience.
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Re: Culture de levures - matériel et protocoles

Message par Nezahualcoyotl »

Salut,
Juste de passage rapide ( mais il va falloir que je revienne plus souvent ... enfin!
Dub a écrit : 25 mai 2022 10:43 Bonjour,
je remet en route ce topic, car ce sujet me passionne et je pense cultiver mes levures dans les semaines qui arrivent. Je vois à peu près comment je vais faire grâce à toutes les informations précédentes (un grand merci, car franchement les infos de qualité sur ce sujet ne sont pas si courantes):
-récolte en fond de fermenteur
-nettoyages à la solution isotonique
-mise en conservation grâce à la glycérine
-congélation.
Il ne faut pas congeler tes cellules à ce stade: elles ont accumulé un maximum de stress! Donc oublie! Il faut congeler des cellules en pleinne vitalité! Juste après 24h de culture par exemple!!
Dub a écrit : 25 mai 2022 10:43 pour l’utilisation:
-réalisation d'un starter de 2 litres grâce à à un rinçage+sucre (pour atteindre à 1040 de densité)
-ensemencement avec 25% du starter
-lavage des 75% restant
-mise en conservation,etc...

Je ne pense pas compter les levures car.....un microscope ça coute, ça prend du temps, et c'est chiant. :roll:

J'ai quelques questions à ceux qui ont l'habitude de faire cela:
-vous est-il arrivé d'avoir un gout de levure trop prononcé (car trop de levures)? :cry:
-les quantités vous semblent-elles cohérentes (0,5 litres de starter pour ensemencer 25 litres de mout) :clap:
-comment peut-on détecter une pollution avec une levure sauvage (avant l'ensemencement)?
-comment savoir si le starter est prêt (mesure densité je suppose)?
-votre expérience permet-elle de dire que l'on peut faire cela à l'infini, en restant en mode 'amateur'?
-avec le temps, vous avez acquis de l'expérience sur ce sujet, avez-vous de nouveaux conseils? :think:


Merci pour vos conseils, vos remarques constructives, et retour d'expérience.
Le ratio de l'ensemencement de ton starter est trop important : maximum 1/50 ! afin de produire des cellules jeunes!
Pas de risque d'autolyse des levures par un sur ensemencement classique!
0,5 litre pour 25 litres , c'est trop peu et cela dépend aussi de ta DI !! Compte plutôt 1-3 l suivant ta DI.
La couleur de ton starter va changer, pour devenir crème!
Oui, avec les bonnes techniques , mais disons une dizaine de cycle en amateur
Pratiquer!

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Re: Culture de levures - matériel et protocoles

Message par Dub »

Merci pour ta réponse.
Quand tu dis taux d ensemencement 1/50, je dois comprendre que si je fais un starter de 2 litres, je dois ensemencer avec 2000/50=40ml?
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Re: Culture de levures - matériel et protocoles

Message par Nezahualcoyotl »

Oui!
Avec une resuspension du dépôt ( slurry ) de cellules
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Re: Culture de levures - matériel et protocoles

Message par Dub »

Heuuu, je ne comprends pas ta dernière phrase!