Les levuresCulture de levures - matériel et protocoles

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goulven
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Re: Culture de levures - matériel et protocoles

Message par goulven »

Alors pour la préparation de géloses et avant de couler, c'est passage en bouteilles schott et stérilisation en cocotte (ou autoclave) normalement. J'arrive a garder 2 à 3 mois les miennes. Parfois j'ai des surprises aussi :) :

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Adhafera a écrit :Ah, et y a-t-il une raison d'utiliser dans ce cas de l'eau distillée ? quid du phénomène d'osmose ?
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2- Eau pure car PH neutre et pas d'ion. Dès que l'on fait intervenir un ion, on modifie l'équilibre de l'eau et l'interaction avec la cellule.
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Re: Culture de levures - matériel et protocoles

Message par Adhafera »

Top, merci, ça répond à mes questions.
goulven a écrit :Alors pour la préparation de géloses et avant de couler, c'est passage en bouteilles schott et stérilisation en cocotte (ou autoclave) normalement.
C'est ce que j'ai fait ! Préparation en erlenmeyer puis stérilisation à la cocotte avec papier alu
goulven a écrit :J'arrive a garder 2 à 3 mois les miennes.
Sans scotch ? Tu les conserves comment ? Juste à l'air libre retournées ?


Bon, il ne me reste plus qu'a trouver un moyen de stériliser ces foutues pipettes graduées trop grande... #-o

(Un jour j'aurai un labo comme le tiens goulven, un jour... :p)
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Re: Culture de levures - matériel et protocoles

Message par Dab2 »

J'utilise cette micropipette, en stérilisant les pointes à la cocotte minute (elles sont généralement conçues pour) :
https://fr.aliexpress.com/item/32759182 ... 6c37c2LXO2
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Re: Culture de levures - matériel et protocoles

Message par Adhafera »

Raa, vous allez réussir à me faire craquer, 30€ la micropipette ça fait réfléchir...
:mrgreen:

Tu utilises quel modèle et pour quelle utilité ? 1-5ml ?
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Re: Culture de levures - matériel et protocoles

Message par shonight »

coucou, je me permets de répondre avec ce que j'ai appris en labo :)

Déjà je tiens à dire que j'ai JAMAIS fais de stock avec des levures à bière (on bosse plus avec des procaryotes parfois avec p.pastoris) mais normalement la méthode de travail reste la même, t'as juste moins peur de te prendre des spores de levures dans le nez que de certaines bactéries ^^.

Pour tout ce qui est pipettes en verre (les bonnes vielles pasteurs en verre par exemple), comme pas mal de gens l'ont expliqué un passage à la flamme va la stériliser c'est genre safe. Le soucis que tu peux avoir c'est (et avec les premières manip ça va t'arriver) de mettre ta pipette trop vite en contact avec ton milieu et tuer des levures en les brûlant (c'est du vécu mais avec des boucles d'inoculation ^^) et aussi le fait que tu galères à pipetter des volumes précis avec une pasteur. En labo on a plus tendance à utiliser des micropipettes pour pipettes des cellules et des milieu ça a l'avantage d'être plus précis. Si je dois pipettes des solutions plus dense comme du glycérol par exemple, je prendrais une pipettes à déplacement positif (pour être précis mais c'est cher), ou une seringue sans aiguille (mais tu seras pas stérile et ça sera pas forcément un problème mais j'y reviens plus tard) ou une pasteur en verre justement (j'ai jamais essayé pour le coup pas sûr que ça passe bien bien, faudrait demander à un chimiste ^^).

Les micropipettes c'est justement les pipettes à tips (pointes) en plastiques comme celles de Aliexpress, comme je disais plus tôt on utilise que ça en labo (mais pas les version aliexpress). Tu peux prendre chez eux, perso j'ai pris une pipette 100-1000 microL y a pas mal de temps, elle s'utilise comme une autre. Par contre elles sont pas calibrable et j'ai pas de micro balance chez moi pour vérifier la calibration (avec le confinement je me vois pas arriver en labo pour tester une pipette ^^), donc par pas du principe qu'elle aura 0 erreur, mais pour la culture de levures maison ça fera clairement le café. Evidemment faudra stériliser tes tips (tu peux ne pas le faire et partir du principe que dans un milieu tes levures vont mieux se développer que tout le reste,... mais c'est pas le cas, les bactéries poussent toujours plus vite ^^). On a tendance à autoclaver et à stériliser nos tips à la "dry heat" (chaleur sèche) pour éviter des problèmes de condensations que t'aurais avec la cocotte minutes. Si t'as pas d'autoclave, je saurais pas trop, j'ai lu des articles qui tendait de faire des désinfection à l'UV et qui proposaient ça pour du matos de chirurgie mais les résultats était pas si ouf et c'est ultra dépendant du support, des souches, du temps d'exposition etc... Si tu veux je peux sans soucis demander à mon professeur de bioprocédé comment lui ferait sans autoclave. En soit on préfère utiliser des cocottes minutes et stériliser à la vapeur des milieu liquides (ou la condensation n'est pas un problème justement). Je crois que pour les pipettes j'ai dis tout ce qui me venait d'important ^^. Ah! je diras qu'avec une pipette de 100-1000 et une de 10-100 tu devrais pouvoir faire tout ce qu'il te faut (de mémoire).

Pour les glycerol stocks, nous ce qu'on fait c'est des stocks dans des cryotubes de 2 mL. Je te mets un rapide résumé du protocole qu'on utilise si ça peut aider. D'abord on prépare du glycérol 80% (w/w) en dilluant avec de l'eau déminéralisé, on met 750 microlitre par cryotube, on autoclave et on conserve à température ambiante. Après on bosse avec les milieux de culture nous.... Comme tu l'as dit, la pression osmotique est importante, pour résumer dans un milieu hypertoniques (avec trop de sels), tes cellules vont libérer de l'eau pour rééquilibrer les concentrations entre les deux cotés de leur membranes. Si la solution est trop concentré en sel, la cellule va totalement se vider, n'aura plus d'eau, péter et mourir. De la même façon dans une solution hypotonique (avec pas ou trop peu de sel), les cellules vont se gorger d'eau, pour diluer leur sels, elles vont se gonfler, exploser et mourir. Donc ouais l'équilibre osmotique est pas mal important ^^. Le problème de l'eau dém c'est qu'elle est pas ultra chargé en sel.. j'ai jamais tenté, ça me semble pas optimal mais le mieux c'est d'essayer et de comparer avec d'autres méthode. Bon pour en revenir au stocks, dans nos cryotubes, on ajoute 750 microL de milieu inoculer la veille avec les cellules d'intérêt. (Si t'as besoin d'aide pour faire des cultures en erlenmeyer hésite pas ^^) Et enfin on mélange en retournant les tubes doucement (faut surtout pas vortex, ou secouer trop, fort c'est quand même des gentilles cellules vivantes qui sont dans ton tube :) ). On laisse incuber à température ambiante une heure ou deux et enfin on conserve à -70°C. Pour le coup si le process est bien fait on garde nos culture jusqu'à 10 ans (pour des bactéries). (Si tu veux des références, qui parlent de cryo, je me ferais un plaisir de chercher ce que j'ai :) )

Enfin pour conserver tes levures à température ambiante dans l'eau, je le ferais juste pas. Même si ça tient, c'est plus parce que tes levures vont ralentir le métabolisme à cause des conditions de merdes que tu leur donne, alors que tu pourrais les mettre dans des milieux cools et gentils pour elle :). D'ailleurs si ton moût contient que tes levures d'intérêt et rien d'autre niveau vivant, t'évites de mettre des facteurs sélectifs dur pour tes levures et tu minimise un peu les risques de mutations..

Encore un point pour tout ce qui est bosser avec des microorganismes, bosse avec un bec bunsen. En fait ta flamme, va créer une "cloche" d'air stérile autour d'elle ou tu pourras travaille en bonne condition. Met pas surtout pas de gant et désinfecte toi les mains à l'éthanol (c'est pour éviter d'avoir des gants brûlés qui te fondent sur les mains). Tout ce qui est métallique (comme boucle d'inoculation) ou verre en borosilicate (comme les pipettes pasteur, ou les lames de microscopes (pour certaines techniques) ) ça tient la flamme et tu peux les stériliser à la flamme.

Ah oui! pour les plaques de pétrie, on les enrobe dans de la parfilm, justement pour éviter les échange avec l'air extérieur. Je crois que ça se fait justement en culture amateur avec du cellophane (j'ai pas tester faut voir avec des gens qui ont fait les 2). En enfin tu peux prendre du sterile indicator tape pour tout ce que tu stérilise (genre des tips de pipette ou des milieux de culture) pour t'assurer que t'as stériliser assez de temps, je crois qu'il en ont sur aliexpress.

Je crois que j'ai répondu plus ou moins à tout. j'espère que ça aide et que c'est pas trop indigeste ^^. Si tu veux un livre qui parle du sujet je peux conseiller le fameux Yeast de Chris White, je l'ai eu en main que 30 minutes, et je l'ai vite feuilleté mais il avait l'air assez bien et assez juste niveau microbio
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Re: Culture de levures - matériel et protocoles

Message par Dab2 »

Merci shonight pour toutes ces infos c'est top.

J'utilise une micropipette 100-1000 µL, c'est parfait pour les manips de comptage.
Sur la précision des micropipettes Dragonlab, Catuvolcos les avaient passées au banc d'essai il y a quelques années, c'était assez conclusif : viewtopic.php?p=334677
Pour le prix, en amateur, je regrette pas l'achat, c'est bien pratique :)
Pour la stérilisation des pointes à la cocotte minute, la condensation est effectivement un soucis, je pense que le mieux ce serait d'utiliser des pointes achetées stériles.
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Re: Culture de levures - matériel et protocoles

Message par Adhafera »

Top les gars, merci pour vos réponses.
shonight a écrit :Pour tout ce qui est pipettes en verre (les bonnes vielles pasteurs en verre par exemple), comme pas mal de gens l'ont expliqué un passage à la flamme va la stériliser c'est genre safe. Le soucis que tu peux avoir c'est (et avec les premières manip ça va t'arriver) de mettre ta pipette trop vite en contact avec ton milieu et tuer des levures en les brûlant (c'est du vécu mais avec des boucles d'inoculation ^^) et aussi le fait que tu galères à pipetter des volumes précis avec une pasteur. En labo on a plus tendance à utiliser des micropipettes pour pipettes des cellules et des milieu ça a l'avantage d'être plus précis.
Ok, donc le passage à la flamme selon toi suffirait. Bon à savoir.
Pour limiter les risques, je pense que je vais me prendre une micropipette 200µL-1mL. Avec ces volumes, je pourrais déplacer mes levures dans mes différents process.
Pour les volumes plus gros de milieu, j'ai modifié mes process pour pouvoir utiliser mes pipettes graduées en verre et stériliser après coup les récipients.
Ça devrait le faire :)
shonight a écrit :Tu peux prendre chez eux, perso j'ai pris une pipette 100-1000 microL y a pas mal de temps, elle s'utilise comme une autre. Par contre elles sont pas calibrable et j'ai pas de micro balance chez moi pour vérifier la calibration (avec le confinement je me vois pas arriver en labo pour tester une pipette ^^), donc par pas du principe qu'elle aura 0 erreur, mais pour la culture de levures maison ça fera clairement le café.
Oui, je n'ai pas besoin d'être super précis. Et puis comme l'a rappelé Dab2, la DLab à plutôt bonne presse en matière de précision.
shonight a écrit :Evidemment faudra stériliser tes tips (tu peux ne pas le faire et partir du principe que dans un milieu tes levures vont mieux se développer que tout le reste,... mais c'est pas le cas, les bactéries poussent toujours plus vite ^^). On a tendance à autoclaver et à stériliser nos tips à la "dry heat" (chaleur sèche) pour éviter des problèmes de condensations que t'aurais avec la cocotte minutes. Si t'as pas d'autoclave, je saurais pas trop, j'ai lu des articles qui tendait de faire des désinfection à l'UV et qui proposaient ça pour du matos de chirurgie mais les résultats était pas si ouf et c'est ultra dépendant du support, des souches, du temps d'exposition etc...
J'ai juste un four classique de cuisine et une cocotte-minute.
Si je met les tips dans une boite plastique dans la cocotte, je suppose qu'il y aura tout de même ce problème de condensation ? Je testerai tout de même (car ce qui me freine avec tout ça c'est que je n'ai pas envie d'avoir des trucs jetable : je me suis toujours arrangé pour avoir du matos en verre réutilisable, c'est pas pour commencer à avoir des tips jetable...)

shonight a écrit :Si tu veux je peux sans soucis demander à mon professeur de bioprocédé comment lui ferait sans autoclave.
Volontiers - avec du matos maison de M. Toulemonde.
shonight a écrit :Pour les glycerol stocks, nous ce qu'on fait c'est des stocks dans des cryotubes de 2 mL. Je te mets un rapide résumé du protocole qu'on utilise si ça peut aider. D'abord on prépare du glycérol 80% (w/w) en dilluant avec de l'eau déminéralisé, on met 750 microlitre par cryotube, on autoclave et on conserve à température ambiante.
Ah super, je me demandais si je pouvais passer en cocotte mes micro-tubes avec 700µL de solution glycérolée justement ! c'est parfait du coup.

shonight a écrit :Si tu veux un livre qui parle du sujet je peux conseiller le fameux Yeast de Chris White, je l'ai eu en main que 30 minutes, et je l'ai vite feuilleté mais il avait l'air assez bien et assez juste niveau microbio
Yep, ça fait un bout de temps qu'il est dans ma bibliothèque celui-là et c'est mon bouquin de chevet du moment :mrgreen:
Dab2 a écrit :J'utilise une micropipette 100-1000 µL, c'est parfait pour les manips de comptage.
[...]
Pour la stérilisation des pointes à la cocotte minute, la condensation est effectivement un soucis, je pense que le mieux ce serait d'utiliser des pointes achetées stériles.
Je vais sûrement craquer pour ce modèle.
Tu as déjà essayé de stériliser les tips à la cocotte ? Même dans une boite plastique ? Du coup elles sont gorgées d'eau et pas moyen de l'évacuer c'est ça ?
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Re: Culture de levures - matériel et protocoles

Message par Dab2 »

Oui je l'ai déjà fait, en mettant les pointes dans un petit bocal en verre avec le couvercle pas tout à fait fermé pour que la vapeur puisse rentrer et stériliser. Forcément, il y a un peu d'eau sur les pointes quand tu les sors, une partie s'évapore rapidement du fait de la chaleur mais il en reste toujours un peu. Si tu laisses sécher à l'air libre elles ne sont plus stériles et si tu fermes hermétiquement le couvercle... ben tu gardes de l'eau dedans, et moi ça me plaît pas trop. La fois où je l'ai fait j'avais laissé le couvercle posé mais pas fermé hermétiquement pour que ça sèche. Pas eu de soucis ensuite mais bon je sais pas ce que ça vaut.
Sinon pour les comptages y'a l'option de verser un peu de liquide dans un tube non stérile et d'utiliser des pointes non stériles pour compter, ensuite tu jettes le liquide.
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Re: Culture de levures - matériel et protocoles

Message par Jinac »

Hello !

Petite idée, dites-moi si c'est con, mais si après passage à la cocotte, on rempli son tips de pipette genre au max, qu'on vide ça dans un récipient poubelle (toujours dans la bulle de stérilité du busnen) et qu'on fait ça mettons 2 fois ou 3 fois, est-ce qu'on peut pas considéré qu'on s'est affranchi de la condensation sur les tips ?

Ma question est intéressée car j'ai eu sur lbc une micropipette volume fixe 50microL à vraiment pas cher et je pensais l'utiliser pour mes comptages avec ce process...
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Re: Culture de levures - matériel et protocoles

Message par shonight »

hmm, en soit le fait de travailler à côté du bec va pas stériliser le liquide que tu vas faire passer dans ton tips :/ La question c'est de savoir si le liquide que tu vas mettre dans ton tips a une plus grande ou une plus petite charge microbienne que le condensat qui était déjà dedans ^^ (question dont j'attends la réponse de mon professeur de bioprocédé). Sur le papier, le soucis c'est d'avoir un dépôt liquide dans ton tips qui va être un endroit sympa pour permettre à des bactéries ou autres pathogènes sauvages de se développer. Si tu rinces tes tips à l'eau par exemple ton va toujours garder un peu d'eau dans ton tips et ça va faire un potentiel milieu pour développer des trucs sauvages :/

Je pense que le mieux à faire ça serait de tester, du style tu prépare des boîte de pétri avec un milieu non sélectif. J'avais lu que pour la culture de levure pour la brasserie, les gens faisait leur milieu d'agar avec du moût je crois, ben pour le coup ça serait une bonne idée. Tu fais ton milieu de culture que tu stérilise bien, tu rempli, je dirais 8 plaques. Dans la première tu mets rien à part le milieu, dans la deuxième tu mets de l'eau stérile que t'auras pipetté avec tes micropipettes qui sortent de la cocotte minute et refroidi sans rien faire, dans la 3ème de l'eau avec tes tips stérilisé à la cocotte et rincé comme tu pensais le faire et si t'es motivé essai une dernière plaque en rinçant avec de l'éthanol, ça sèche à température ambiante et ça tue pas mal de truc (pas tout mais pas mal de truc). Avec 8 plaques tu peux tout faire en duplicat pour valider un peu tes tests, tu regardes sur quelles plaques quelque chose pousse et tu sais si ton process protège des pathogènes sauvages. Enfin si t'es motivé ^^

Je me permet juste une question, lbc c'est l'acronyme de quoi?