Instruments de mesuremateriel comptage de levures

Densimètres, refractomètres, thermomètres et autres outils plus ou moins indispensables

Modérateur : Jean-Luc

Règles du forum
Chers membres, merci de prendre connaissance et respecter les quelques règles de bon sens suivantes avant de poster votre message :
- Vous assurer que vous postez dans la bonne rubrique
- Vérifier qu'il n’existe pas déjà une réponse à votre question ou un sujet identique
- Prendre conscience que vos propos n’engagent que vous et que vous devrez en assumer la paternité
- Vérifier les sources des informations que vous diffusez, en vous assurant le cas échéant de respecter les droits d’auteur qui peuvent être liés aux informations, images ou documents cités
- Prendre soin de respecter vos interlocuteurs et bannir les insultes et autres propos diffamatoires ou dégradants
- Vous assurer de rester autant que faire se peut dans le sujet exposé
- Prendre le temps de vérifier l’orthographe et la grammaire de votre message
Merci par avance de votre contribution à préserver le bon esprit de ce forum.
WeDloMiS
Ch'ti nouveau
Messages : 160
Inscrit depuis : 4 ans 3 mois
Brasseur : Amateur
Localisation : Toulon
A remercié : 4 fois
A été remercié : 12 fois

Re: materiel comptage de levures

Message par WeDloMiS »

Avant toute chose, je tiens à vous remercier tous les 3 pour votre aide. Je pense que j'ai des pistes à explorer pour essayer d'en trouver la cause. Toutefois, je vais apporter quelques commentaires pour vous donner un peu plus d'informations sur le process que j'ai pu suivre.
Jinac a écrit :Est-ce que t'as attendu avec ta solution de bleau avant de rediluer ?

Généralement on dilue à la toute fin avec le bleu (rapport 1/1) et on attends plusieurs minutes pour laisser le temps de pénétrer...
Non pas du tout. Mon approche n'est pas bonne du tout à ce niveau.

J'ai mis 1mL de levure, tout de suite derrière 0,5mL de bleu de méthylène et 9.5mL de solution isotonique.

Le bleu de méthylène a été préparé à partir d'une poudre. Dosage 1g pour 1L. J'ai préparé une bouteille de 500mL que j'ai mis de côté. Je ne pense pas que ca perde ces propriétés avec le temps. A confirmer ...

Par contre, une chose est certaine je suis très loin du rapport 1/1 :o :o
Cede a écrit :Pas mieux que Jinac !

Tu dilues tes levures et ensuite tu balances la coloration, tu attends quelques minutes et tu comptes.
Il ne faut pas attendre une heure non plus, car au bout d'un long moment elles ont tendance à absorber le bleu.
Oui c'est ce que j'ai fait et je peux te dire que pour la photo d'hier, j'ai attendu très longtemps puisque c'est un tube à essai que j'avais préparé dimanche soir. Donc plus de 24H d'actions ...

Je pense que le bleu est trop dilué, et donc que la concentration soit trop faible pour pouvoir être absorbée.
Hush a écrit :Bonjour,
Pour ce que l'on peut distinguer sur ta photo, on dirait que tes levures ont formé des ascospres. Il faudrait les observer sur une lamelle à plus fort grossissement en cherchant à améliorer la qualité.
Peut être serait il préférable de commencer en observant une "levure neuve" . Tu réhydrates une pincée de levure et tu observes sur une lame classique, pas la cellule de comptage. Avec la cellule j'ai toujours un contraste moins bon et parfois des artefacts. Tu cherches le meilleur réglage. Tu colores et tu observes . Tu "génocides" la moitié de ta préparation en chauffant au micro onde comme tu as déjà fait, tu colores et tu observes toujours sur une lame classique.

Evidemment, tu viens nous faire un compte rendu. :D
Bon TP !
Hush
J'en avais tiré la même conclusion hier. Je vais sacrifier un sachet de levure sèche pour assurer une observation.

Je vais juste appliquer un protocole plus strict avec toutes les informations fournies. Je vais extraire dans un tube à essai 1mL de levure, y ajouter 4mL de solution isotonique et enfin ajouter 5mL de bleu de méthylène.

J'ai remarqué que la qualité d'observations avec une cellule de comptage et bien moins qualitative qu'une observation sur une lame classique.

Je vais répéter ces opérations et je reviens vers vous après mon TP !! :D :D

Concernant mon observation d'hier, les ascospres sont possiblement responsables de mes constatations de plusieurs "noyaux". Si j'ai bien compris (merci Wikipédia) c'est une division cellulaire foireuse qui engendre des cellules défaillantes. Elles ne sont plus identiques à la mère mais a perdu une bonne partie de ces chromosomes :alien: :alien: Quand je disais qu'elles étaient en mode super héros ... j'étais pas loin !! :lol: :lol:

Merci encore à tous et bonne journée !!
Hush
Brasseur
Brasseur
Messages : 1274
Inscrit depuis : 14 ans 8 mois
Brasseur : Amateur
Localisation : 78
A remercié : 27 fois
A été remercié : 136 fois

Re: materiel comptage de levures

Message par Hush »

Bonjour,
Pour les premières observations et pour se faire la main, de la levure fraîche de boulanger ou de la sèche marche très bien.
J'ai fait mes premières observations avec de la levure de boulanger et une cartouche d'encre bleue pour stylo plume (elle contenait du bleu de méthylène). Ca fonctionne très bien.
Soigne le réglage du microscope (éclairage et contraste).
Hush
WeDloMiS
Ch'ti nouveau
Messages : 160
Inscrit depuis : 4 ans 3 mois
Brasseur : Amateur
Localisation : Toulon
A remercié : 4 fois
A été remercié : 12 fois

Re: materiel comptage de levures

Message par WeDloMiS »

Ca y est !! Le test est bien plus concluant que ma première expérience. Merci @Jinac, @Cede et @Hush pour leur excellent conseil.

Pour les prochains si ça peut servir, voici le process suivi :

Expérience 1 :


1 - Préparation d'une solution avec de la levure fraiche de boulanger / Dosage au hasard de levure dans une solution isotonique (9g NaCl / L)
2 - 1mL de cette préparation dans une tube à essai
3 - Ajout de 4mL de solution isotonique
4 - Ajout de 5mL de solution de bleu de méthylène (1g de poudre / L)
5 - Quelques minutes d'attente / Le temps de nettoyer le matériel utilisé
6 - Préparation d'une lame et d'une cellule de comptage
7 - Attente quelques minutes / Préparation de la zone d'observation
8 - Observation

Expérience 2 :

1 - Préparation d'une solution avec de la levure fraiche de boulanger / Dosage au hasard de levure dans une solution isotonique (9g NaCl / L)
2 - 1mL de cette préparation dans une tube à essai
3 - Passage au microonde rapide / 5 secondes environ
4 - Refroidissement du tube sous l'eau froide
5 - Ajout de cette même préparation / Ajout de levures vivantes
3 - Ajout de 4mL de solution isotonique
4 - Ajout de 6mL de solution de bleu de méthylène (1g de poudre / L)
5 - Quelques minutes d'attente / Le temps de nettoyer le matériel utilisé
6 - Préparation d'une lame et d'une cellule de comptage
7 - Attente quelques minutes / Préparation de la zone d'observation
8 - Observation

Observation en images :

Expérience 1 :

Image

-> Solution sur une lame classique

Image

Image

-> 2 vues de cette même solution sur la cellule de comptage

Expérience 2 :

Image

-> Je n'ai pas précisé dans le process du haut mais j'avais préparé une lame avant de mettre le bleu. Je voulais comparer avant et après l'ajout de bleu. C'est concluant puisqu'on peut voir ici qu'il est impossible de différencier une cellule vivante d'une cellule morte avant l'ajout de la solution de bleu de méthylène.

Image

Image

-> Solution de l'expérience 2 sur une lame classique / 2 vues

Image

-> Solution sur une cellule de comptage


Conclusion :

Je suis très satisfait du résultat de cette expérience qui m'a permis de valider une process de différenciation des levures vivantes et mortes. Ca m'a aussi permis de valider un process de comptage.
Les photos ne sont pas aussi représentatives de ce que je peux avoir à l'oculaire mais ça permet d'avoir une idée de ce qu'on peut observer. Je suis avec le téléphone, pas évident de bien positionné l'objectif faire une mise au point ...
En terme d'observation tout est assez clair, il est juste dommage que je ne puisse pas régler le contraste sur le microscope pour pouvoir faire ressortir la grille de la cellule de comptage.
A l'oeil je peux la différencier assez distinctement mais ça pourrait être mieux. Au niveau des photos, c'est plus difficile. C'est dommage puisqu'un comptage sur des clichés photos pourrait s'avérer pratique.

Encore merci à tous et à bientôt pour la prochaine expérience !! :D :D
Avatar de l’utilisateur
Leberrichondud
Maître Brasseur
Maître Brasseur
Messages : 3280
Inscrit depuis : 2 ans 3 mois
Mon équipement : Frigo régulé
un laveur /desinfecteur de bouteilles DIY; refroidisseur avec pré refroidissement de l eau
maischfest avec une cuve de rinçage électrique, sur chariot avec chambre chaude de fermentation.
Brasseur : Amateur
Localisation : 06530 peymeinade
A remercié : 28 fois
A été remercié : 103 fois

Re: materiel comptage de levures

Message par Leberrichondud »

Merci pour ce retour d'expérience en image qui pourra en aider plus d un (je me mets pas dans le lot) à comprendre le principe d action du bleu de méthylène.

Et du coup, tu as recompté tes vieilles levures ?
Hush
Brasseur
Brasseur
Messages : 1274
Inscrit depuis : 14 ans 8 mois
Brasseur : Amateur
Localisation : 78
A remercié : 27 fois
A été remercié : 136 fois

Re: materiel comptage de levures

Message par Hush »

Bonjour,
Merci pour le retour. Protocole validé :clap:
Quelques amorces de réponses en vrac... Comme elles me viennent.
Pour tuer des levures je les fais "cuire à 80-90°C" plusieurs minutes. Je n'arrive pas non plus à avoir les lignes de la cellule de comptage nettes en même temps que les levures. Normal, elles ne sont pas dans le même plan et à fort grossissement on a pas assez de profondeur de champ. Tu as trop de cellules dans chaque carré pour pouvoir compter de façon fiable, mais tu le sais probablement déjà.
Pour les photos, ca vaut le coup de passer du temps à se faire un support stable pour le téléphone ou une tablette. On peut ainsi prendre une photo puis compter tranquillement sur l'écran d'un ordi. De plus on peut profiter du zoom du téléphone. Si les lignes des cellules ne sont pas très nettes, ce n'est pas bien grave, je préfère bien voir les levures.
Petite question : tu utilises quoi comme microscope ? Monoculaire, binoculaire ?
Leberrichondud a écrit :Et du coup, tu as recompté tes vieilles levures ?
Si ces vieilles levures sont en sporulation, la technique du bleu de méthylène est elle encore applicable et fiable ?
Encore bravo.....
Hush
WeDloMiS
Ch'ti nouveau
Messages : 160
Inscrit depuis : 4 ans 3 mois
Brasseur : Amateur
Localisation : Toulon
A remercié : 4 fois
A été remercié : 12 fois

Re: materiel comptage de levures

Message par WeDloMiS »

@Leberrichondud Avec plaisir !! C'est ma maigre contribution sur ce topic mais j'espère que ça peut en motiver à se lancer. C'est assez passionnant et ouvert à tous. J'en suis la preuve vivante !! :lol: :lol:

Concernant mes anciennes levures, je vais retenter l'expérience en appliquant le même protocole qu'hier mais j'ai un gros doute sur les échantillons. Je crains que ce ne soit pas récupérable. Je vais toutefois tenter, ça ne coûte rien.
Hush a écrit : Pour tuer des levures je les fais "cuire à 80-90°C" plusieurs minutes.
J'ai remarqué à l'observation, à ma grande surprise, que le micro-onde n'avait pas été suffisant pour tuer l'ensemble des levures présentes dans le tube. Je pensais que ça aurait été radical mais loin de là.
C'est la raison pour laquelle dans mon protocole d'expérience 2, j'avais ajouté des levures vivantes. Je ne voulais pas avoir une cellule de comptage exclusivement avec des cellules mortes. Et pourtant ... :D
Hush a écrit :Je n'arrive pas non plus à avoir les lignes de la cellule de comptage nettes en même temps que les levures. Normal, elles ne sont pas dans le même plan et à fort grossissement on a pas assez de profondeur de champ. Tu as trop de cellules dans chaque carré pour pouvoir compter de façon fiable, mais tu le sais probablement déjà.
Ah ! Ca me rassure pour les lignes. D'autant que je grossis peut-être un peu trop. Objectif 40x avec oculaire 12.5x soit 500x. A l'oeil, ce n'est pas gênant mais en photo il faut que j'y travaille.
J'ai effectivement conscience que dans le cadre de cette expérience j'avais besoin d'une dilution supplémentaire pour pouvoir envisager un comptage. Le but étant limité à une observation, je n'ai pas modifié la dilution pour aboutir à un comptage. Ca sera la prochaine étape. :roll:
Hush a écrit : Pour les photos, ca vaut le coup de passer du temps à se faire un support stable pour le téléphone ou une tablette. On peut ainsi prendre une photo puis compter tranquillement sur l'écran d'un ordi. De plus on peut profiter du zoom du téléphone. Si les lignes des cellules ne sont pas très nettes, ce n'est pas bien grave, je préfère bien voir les levures.
Oui j'ai vu quelques montages DIY intéressant. Même avec une petite webcam. Ca sera une future évolution de mon approche. :D
Hush a écrit : Petite question : tu utilises quoi comme microscope ? Monoculaire, binoculaire ?
Monoculaire. Il s'agit d'un vieux microscope d'origine polonaise apparemment. Marque PZO Warszawa

Il s'agit de ce modèle :

Image

Avec Objectif 10x 20x et 40x
Oculaire 12.5x
Avatar de l’utilisateur
Leberrichondud
Maître Brasseur
Maître Brasseur
Messages : 3280
Inscrit depuis : 2 ans 3 mois
Mon équipement : Frigo régulé
un laveur /desinfecteur de bouteilles DIY; refroidisseur avec pré refroidissement de l eau
maischfest avec une cuve de rinçage électrique, sur chariot avec chambre chaude de fermentation.
Brasseur : Amateur
Localisation : 06530 peymeinade
A remercié : 28 fois
A été remercié : 103 fois

Re: materiel comptage de levures

Message par Leberrichondud »

Hush a écrit :Bonjour
Leberrichondud a écrit :Et du coup, tu as recompté tes vieilles levures ?
Si ces vieilles levures sont en sporulation, la technique du bleu de méthylène est elle encore applicable et fiable ?
Encore bravo.....
Hush
Là, tu me mets le doute et je veux pas répondre de façon erroné ou en espérant que...ça fait bien trop longtemps que je ne fais plus de bacterio/mycologie
Si j y pense, je demanderai au taf, on vient d ouvrir un service dédié à la mycologie avec des experts en la matière (je promet rien.... J ai tendance à vite oublier) :)
Avatar de l’utilisateur
Cede
Maître Brasseur
Maître Brasseur
Messages : 4178
Inscrit depuis : 16 ans 2 mois
Je suis tuteur : oui
Mon équipement : Un peu trop :)
Brasseur : Amateur
Localisation : Clapham / xToulouse
A remercié : 28 fois
A été remercié : 144 fois
Contact :

Re: materiel comptage de levures

Message par Cede »

Super ça !

Tu vas avoir du mal a compter, car tu n'as pas assez dilué.
Il ne faut que quelques cellules par case, sinon ça devient l'enfer.
Je dilue vraiment beaucoup plus, jusqu'à 1:99 mais je n'ai pas tout a fait la meme cellule.

Pour le comptage automatisé d'ailleurs: https://github.com/grishagin/CellCounting
http://www.minibrasse.ca
En cours: Oud bruin 2020 Phase2, PA Jericho, Rousse Québécoise, Krispy Lager
WeDloMiS
Ch'ti nouveau
Messages : 160
Inscrit depuis : 4 ans 3 mois
Brasseur : Amateur
Localisation : Toulon
A remercié : 4 fois
A été remercié : 12 fois

Re: materiel comptage de levures

Message par WeDloMiS »

Leberrichondud a écrit :
Hush a écrit :Bonjour
Leberrichondud a écrit :Et du coup, tu as recompté tes vieilles levures ?
Si ces vieilles levures sont en sporulation, la technique du bleu de méthylène est elle encore applicable et fiable ?
Encore bravo.....
Hush
Là, tu me mets le doute et je veux pas répondre de façon erroné ou en espérant que...ça fait bien trop longtemps que je ne fais plus de bacterio/mycologie
Si j y pense, je demanderai au taf, on vient d ouvrir un service dédié à la mycologie avec des experts en la matière (je promet rien.... J ai tendance à vite oublier) :)
Sympa !! Tu peux même leur montrer la photo à l'occaz !! :D :D

Même j'essaierai de refaire des clichés un process plus fiable.
Cede a écrit :Super ça !

Tu vas avoir du mal a compter, car tu n'as pas assez dilué.
Il ne faut que quelques cellules par case, sinon ça devient l'enfer.
Je dilue vraiment beaucoup plus, jusqu'à 1:99 mais je n'ai pas tout a fait la meme cellule.

Pour le comptage automatisé d'ailleurs: https://github.com/grishagin/CellCounting
Effectivement, il faut que je dilue beaucoup plus. Ce n'est pas gérable avec une telle concentration de levures.

Sympa le projet sur Github. Si j'arrive à avoir une meilleure qualité de prises de vue, je tenterais aussi l'aventure !! :)
WeDloMiS
Ch'ti nouveau
Messages : 160
Inscrit depuis : 4 ans 3 mois
Brasseur : Amateur
Localisation : Toulon
A remercié : 4 fois
A été remercié : 12 fois

Re: materiel comptage de levures

Message par WeDloMiS »

Voilà j'ai retenté l'expérience avec les fameuses levures 2 ans d'âge (peut-être même un peu plus) et les résultats sont tout aussi catastrophiques. J'émets même un doute sur le fait que ce soit réellement des levures ou elles ont sacrément morflés.

J'ai suivi le même process que pour mes expériences précédentes mais le résultat est tout autre.

Avant la coloration au bleu sur une lame classique :

Image

Image

--> Je n'arrive même pas à avoir quelques choses de net. Je n'ai que très peu dilué à ce niveau et la concentration est un peu plus élevé. En tout cas, je vois des cellules avec plusieurs points au centre, des genres de noyaux mais multiples. C'est assez variable mais ça varie en général entre 2 et 5 avec une plus grosse proportion autour de 3 ou 4.

Après la coloration au bleu :

Image

Image

--> Aucune cellule (ou très très peu) semble se colorer sauf l'intérieur de ces fameux "noyaux". La cellule reste non coloré sur son ensemble mais les noyaux se colorent en plus ou leur contour.

De ce fait, l'observation est plus claire (en plus plus dilué avec le bleu en rapport 1/1).

Malgré tout, je pense que la conclusion est sans appel. Direction poubelle !! :D :D

Mais si quelqu'un sait à quoi ca peut correspondre OU si il s'agit de levures qu'est ce qu'il les a rendu mutantes ? :lol: :lol:
Répondre